香菇多糖的制備及抗煙草花葉病毒(TMV)作用機(jī)制的研究.pdf

1、香菇多糖(Lentinan，β-(1-3)-D-glucan)，廣泛存在于香菇子實體和菌絲體細(xì)胞壁中，眾多研究表明，其具有降血糖、降血脂、增強(qiáng)免疫力、抗腫瘤、抗病毒等生物學(xué)功能。不同來源的真菌多糖因其化學(xué)結(jié)構(gòu)、分子尺寸及鏈構(gòu)象的不同，其生物功能活性存在較大差異。從香菇中有效地提取和純化出高純度多糖，并研究其化學(xué)分子結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系是實現(xiàn)香菇多糖應(yīng)用價值的重要步驟。
　　采收后的香菇培養(yǎng)基是香菇栽培的廢棄物，大量廢棄的香菇培養(yǎng)基因缺

2、乏有效的管理和利用，造成水和土壤的污染，還帶來資源的浪費(fèi)。雖然近年來國內(nèi)已將食用菌培養(yǎng)基廢棄物用做食用菌再生產(chǎn)的配料、動物飼料、堆肥、栽培基質(zhì)、生態(tài)環(huán)境修復(fù)材料等來開發(fā)利用(Phan and Sabaratnam，2012)，但從留存有大量的菌絲體而富含多糖類化合物的香菇培養(yǎng)基廢棄物中提取多糖用作生物農(nóng)藥的研究報道未見。
　　本文主要以香菇培養(yǎng)基廢棄物為試驗材料，分析了提取香菇多糖的影響因素，并在單因素試驗的基礎(chǔ)上，利用Box-B

3、enhnken中心組合試驗和響應(yīng)面分析法對提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。將提取的香菇粗多糖進(jìn)行分離純化、理化性質(zhì)分析、多糖均一組分結(jié)構(gòu)的初步鑒定，進(jìn)而對純化后香菇多糖進(jìn)行了抗TMV活性和作用機(jī)制的研究，得出以下研究結(jié)論:
　　1、在單因素考察基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Benhnken中心組合方法進(jìn)行四因素（提取溫度、提取時間、料液比、醇沉濃度）三水平的實驗設(shè)計，以得率為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面分析。從香菇培養(yǎng)基廢棄物中提取香菇多糖的優(yōu)化工藝參數(shù)為:提取溫

4、度為90℃，提取時間為4h，液物比為15∶1，醇沉濃度為80％。在此條件下，香菇多糖實際得率為4.11％，與模型預(yù)測值4.12％接近。
　　2、香菇培養(yǎng)基廢棄物經(jīng)水提醇沉、Sevag法脫蛋白、活性炭脫色后得粗多糖，經(jīng)DEAE-Sephadex A-52離子交換柱層析得到三種均一多糖組分CLT1、CLT2、CLT3，經(jīng)Sephadex-200凝膠柱層析得高純度多糖LNT。CLT1、CLT2、CLT3中性糖含量分別為78.97％，12

5、.62％，3.12％，LNT的含量為80.25％，不含蛋白質(zhì)和還原性糖，是非淀粉類多糖。LNT分子量為26 kDa。紫外光譜分析，多糖LNT在260nm和280nm未見核酸和蛋白吸收;經(jīng)紅外光譜分析可知，多糖LNT具有明顯的多糖特征，且主要含α-糖苷鍵。GC測定可知，多糖LNT主要由L-阿拉伯糖、D-葡萄糖、D-半乳糖組成，并且還有少量的巖藻糖(Fuc);含量分別為2.8％、87.5％、9.6％，其摩爾組成比大約為1∶31∶3。

6、　　3、香菇多糖LNT對TMV有顯著的抑制作用，其中當(dāng)多糖與病毒混和接種時，其對病毒的抑制率在80％以上。此外，香菇多糖對TMV侵染位點(diǎn)還有較強(qiáng)的保護(hù)作用，且具有明顯的抑制病毒增殖的能力。
　　4、進(jìn)一步從生理和分子生物學(xué)的角度對多糖LNT抗煙草花葉病毒的機(jī)制進(jìn)行了探討。結(jié)果表明，香菇多糖對TMV病毒粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)無直接破壞作用，但對TMV-CP在寄主體內(nèi)的表達(dá)量具有明顯的抑制作用。用500μg/mL LNT處理煙草可以誘導(dǎo)植物早期

7、防御反應(yīng)因子——H2O2、NO的產(chǎn)生和SA的大量積累;同時，LNT處理還可以引起煙草防御酶系中PAL、POD和PPO酶活性的提高;Real Time PCR檢測部分抗病基因表達(dá)情況發(fā)現(xiàn):植物體內(nèi)與水楊酸信號途徑有關(guān)的酸性PR蛋白基因NbPR1a在處理后12內(nèi)表達(dá)量提升了12倍;與H2O2和NO的產(chǎn)生相關(guān)的NbrbohB和NOA1基因均有不同程度的提高。表明，香菇多糖對煙草花葉病毒的防治是通過抑制病毒活性和激活植物體內(nèi)以水楊酸信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑