藥學(xué)畢業(yè)論文青鯊軟骨血管生成抑制因子的制備

1、<p><b>　　本科畢業(yè)論文</b></p><p><b>　?。?0 屆）</b></p><p>　　青鯊軟骨血管生成抑制因子的制備</p><p>　　所在學(xué)院 </p><p>　　專業(yè)班級 藥學(xué)

2、 </p><p>　　學(xué)生姓名 學(xué)號 </p><p>　　指導(dǎo)教師 職稱 </p><p>　　完成日期 年 月 </p><p><b>　　目 錄</b

3、></p><p><b>　　摘要1</b></p><p>　　Abstract2</p><p><b>　　1前言3</b></p><p>　　2實驗材料與儀器3</p><p><b>　　2.1實驗材料3</b></p

4、><p><b>　　2.2主要試劑3</b></p><p><b>　　2.3儀器4</b></p><p><b>　　3實驗方法4</b></p><p>　　3.1分離提取青鯊軟骨總蛋白4</p><p>　　3.2 (NH4)2SO4分級

5、沉淀4</p><p>　　3.3抗氧化活性測定5</p><p>　　3.4雞胚絨毛尿囊膜實驗5</p><p>　　3.5離子交換層析6</p><p><b>　　3.6電泳實驗7</b></p><p>　　3.7 Sephadex G-75凝膠過濾層析8</p>

6、<p>　　4實驗結(jié)果與討論9</p><p>　　4.1(NH4)2SO4分級沉淀結(jié)果9</p><p>　　4.2抗氧化活性測定結(jié)果10</p><p>　　4.3雞胚絨毛尿囊膜實驗結(jié)果10</p><p>　　4.4離子交換層析11</p><p>　　4.5電泳實驗12</p>

7、;<p>　　4.6 Sephadex G-75凝膠過濾層析13</p><p><b>　　5實驗小結(jié)15</b></p><p>　　5.1硫酸銨分級沉淀15</p><p>　　5.2柱層析方法15</p><p>　　5.3抗氧化活性研究16</p><p>　　5

8、.4新生血管生成抑制因子16</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)16</b></p><p><b>　　致謝18</b></p><p>　　[摘要] 目的：軟骨魚軟骨具有顯著的血管生成抑制作用，是抗腫瘤新藥研發(fā)的重要資源。因此，本課題從青鯊軟骨中分離純化出具有較強抗氧化活性的蛋白，并對其抑制新生血管的能力進(jìn)行了

9、比較分析。方法：青鯊軟骨組織破碎后于PBS浸提，低溫離心，(NH4)2SO4分級沉淀得粗蛋白。通過離子交換層析（IEC）和凝膠層析（GFC）進(jìn)行分離純化獲得活性蛋白組分及單體，采用SDS-PAGE電泳檢測蛋白分子量。利用DPPH清除率、羥自由基清除率、還原力三種體外抗氧化實驗測定分段部位和單體的抗氧化活性。結(jié)果：SDS-PAGE電泳結(jié)果所示，考馬斯亮藍(lán)染色顯示為單一條帶，證明已達(dá)到電泳純，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率，測得其分子量為95.9

10、kDa。運用雞胚絨毛尿囊膜（CAM）活性抑制模型進(jìn)行藥理學(xué)研究分析發(fā)現(xiàn)，8 µg 青鯊軟骨血管生成抑制因子（BSFN）對新生血管的抑制率已經(jīng)高達(dá)80.9%。實驗表明它能顯著抑制CAM膜新生血管生成，并且抑制效果具有一定的濃度依賴性。DPPH自由基清除率、羥自由基清除率、還原力三種體外抗氧化實驗顯示，BSFN在10 mg/mL時DPPH清除率、羥自由基清除率、還原力分別為82.68%、7</p><p>

11、　　[關(guān)鍵詞] 青鯊軟骨；血管生成抑制因子；抗氧化活性</p><p>　　The Preparation of angiogenesis inhibitor in Blue shark Cartilage</p><p>　　Abstract: Objective: Preparation and activity evaluation of angiogenesis inhibitor

12、 from Blue shark Cartilage. Method: Break the organization of Blue shark Cartilage, and taking it as raw materials, and we can extract it with PBS. Centrifuging, we can get the crude protein by Precipitating (NH4)2SO4. I

13、n this way, we could obtain activitive protein components and Monomer by separating and puring through IEC and GFC. Evaluate the molecular weight with SDS-PAGE electrophoresis. Make use of ·DPPH cle</p><p

14、>　　Key words: Blue shark Cartilage; Angiogenesis inhibitor; Antioxidant activity</p><p><b>　　1前言</b></p><p>　　我國蘊藏著豐富的海洋生物資源?，F(xiàn)已證實，不少海洋生物活性物質(zhì)具有抗腫瘤、抗病毒、抗真菌、抗艾滋病、抗心腦血管疾病、抗老年癡呆癥以及抗疲勞、

15、增強免疫、延緩衰老等功效。由此引起世界各國對開發(fā)海洋生物的極大興趣，它已成為現(xiàn)代醫(yī)藥保健品開發(fā)研究的熱點[1]。</p><p>　　近年來，腫瘤嚴(yán)重威脅著人類的生命和健康，是僅次于心腦血管疾病危害人類健康的第二大殺手 [2]。目前，已經(jīng)有許多抗腫瘤藥物應(yīng)用于臨床，但多因其副作用大而在應(yīng)用上受到限制。因此，人們逐漸將注意力轉(zhuǎn)向從動植物中提取副作用小的抗腫瘤有效成分。近20年來發(fā)現(xiàn)鯊魚的整個內(nèi)骨骼幾乎全由軟骨組成，

16、并且鯊魚不長腫瘤，推論鯊魚體內(nèi)應(yīng)該存在某種抑制腫瘤生長的物質(zhì)[3]。</p><p>　　推測抑制腫瘤生長的物質(zhì)的作用主要包括：①對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用：鯊魚軟骨中存在的抗腫瘤因子可以直接殺傷腫瘤細(xì)胞、抑制細(xì)胞骨架的形成或使細(xì)胞骨架發(fā)生凝聚和固縮，破壞其結(jié)構(gòu)完整性[4]。②對新生血管生長的抑制作用：鯊魚軟骨蛋白不僅可以抑制雞胚胎血管化和基質(zhì)膠誘導(dǎo)的血管生成，而且還能抑制乳腺癌和人惡性膠質(zhì)瘤的生長并阻止乳腺癌和Lew

17、is肺癌的轉(zhuǎn)移[5]。③抗氧化作用：從鯊魚軟骨中提取得到的一種水溶性組分具有抗炎和止痛的作用，其能清除活性氧自由基、保護細(xì)胞不發(fā)生突變，間接起到抗腫瘤作用[6]。④增強機體免疫力：鯊魚軟骨活性物質(zhì)可激活機體的免疫系統(tǒng)，活化自然殺傷細(xì)胞及巨噬細(xì)胞以增強攻擊癌細(xì)胞的能力[7]。而且鯊魚軟骨多糖對胸腺和脾臟具有刺激作用，能同時活化巨噬細(xì)胞，使其表面伸出較粗大的偽足，提高機體的免疫力，刺激白細(xì)胞分泌腫瘤壞死因子[8]。</p>&

18、lt;p>　　國內(nèi)外越來越多的研究證實，鯊魚軟骨還含有能阻止病理性血管生長的特殊物質(zhì)，從而斷絕腫瘤的血液供應(yīng)，使腫瘤生長減緩、萎縮甚至消失，抗癌作用明顯。而且對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等頑疾也有效[9]。</p><p>　　因此為推動軟骨魚海洋藥物的基礎(chǔ)研究，更為從海洋軟骨魚資源寶庫中開發(fā)新型抗腫瘤藥物。本課題選擇海洋資源豐富的青鯊為研究對象，利用硫酸銨分級沉淀法、離子交換柱層析和凝膠柱層析等技術(shù)，提取分離活性蛋白

19、，并分析比較其在體外的抗氧化活性。同時以近年來頗受關(guān)注的抑制雞胚絨毛尿囊膜（CAM）血管生成模型，進(jìn)行高效抗腫瘤血管生成抑制劑的體外活性評價。本課題的研究，將為海洋資源豐富的軟骨資源高值化利用開辟一條新的途徑，為后續(xù)開發(fā)高效低毒保健的海洋抗腫瘤新藥奠定基礎(chǔ)。</p><p><b>　　2實驗材料與儀器</b></p><p><b>　　2.1實驗材料&l

20、t;/b></p><p>　　青鯊購買于浙江省舟山市定海區(qū)南珍水產(chǎn)市場，種屬由浙江海洋學(xué)院趙盛龍教授鑒定。標(biāo)本存放于浙江海洋學(xué)院食品與藥學(xué)學(xué)院生藥學(xué)實驗室。</p><p><b>　　2.2主要試劑</b></p><p>　　DEAE-52和Sephadex G-75由Pharmacia 進(jìn)口分裝；DPPH、乙醇、磷酸氫鈉、磷酸氫二

21、鈉、鐵氰化鉀、三氯乙酸（TCA）、三氯化鐵、鄰二氮菲、硫酸亞鐵、H2O2、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、甘氨酸、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、SDS、過硫酸銨、TEMED(甲基乙二胺，N，N，N'，N’-tetramethyl ethylenediamine)、蔗糖、琉基乙醇、溴酚藍(lán)、鹽酸、氯化鈉、硫酸銨、氫氧化鈉均為國產(chǎn)分析純。低相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)含有6種已知相對分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)組合試劑購買于上海生物化學(xué)研究所；試驗用水均為自

22、制Millipore超純水。</p><p><b>　　2.3儀器</b></p><p><b>　　3實驗方法</b></p><p>　　3.1分離提取青鯊軟骨總蛋白</p><p>　　用手術(shù)刀剔除青鯊魚肉，取出青鯊軟骨，洗凈，將軟骨剪碎，稱重2600 g，加少量濃度0.02 mol/L

23、 PBS（pH 7.4）緩沖溶液（以下簡稱PBS），用組織搗碎機搗碎，再加入兩倍體積(W/V)的 PBS浸泡提取，緩慢攪拌30 min，4 ℃時提取24 h（每2 h攪拌一次）。低溫高速離心機（溫度4 ℃）離心兩次，轉(zhuǎn)速分別為5000 r/min，10000 r/min，時間分別為15 min，20 min。取離心上清液，即為青鯊軟骨粗提液，測量體積。</p><p>　　3.2 (NH4)2SO4分級沉淀[10

24、]</p><p>　　取青鯊軟骨粗提液5000 mL，在冰浴條件下，緩慢地加入60%(NH4)2SO4細(xì)顆粒，邊加邊攪拌。待(NH4)2SO4完全溶解，靜置4 h，低溫高速離心機離心，轉(zhuǎn)速為10000 r/min，得到青鯊軟骨60 % (NH4)2SO4沉淀蛋白，保留上清液。測上清液體積，再加入100 %的(NH4)2SO4，方法如上，制備100 %的(NH4)2SO4沉淀蛋白。得到的兩種沉淀蛋白分別用2倍體積

25、(W/V)的PBS溶解，低溫高速離心機離心20 min，轉(zhuǎn)速為10000 r/min，得上清液，透析過夜，冷凍干燥成粉。計算提取率。結(jié)果見表2。采用Bradford 法[11]，用牛血清白蛋白作標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定蛋白含量。結(jié)果見表2。</p><p>　　3.3抗氧化活性測定</p><p>　　3.3.1 樣品溶液的制備</p><p>　　將青鯊軟骨60 %與100

26、 % (NH4)2SO4沉淀蛋白，稀釋成濃度為2 mg/mL、4 mg/mL、6 mg/mL、8 mg/mL、10 mg/mL的樣品溶液作抗氧化實驗，選擇抗氧化活性強的樣品溶液上離子交換層析。 </p><p>　　3.3.2 DPPH自由基清除能力</p><p>　　DPPH自由基清除能力測定按照Bersuder（1998）等[12]描述的方法進(jìn)行。取一份1mL樣品與1mL的99.5

27、%乙醇混合，加入濃度為0.02% 的DPPH 99.5%乙醇液250 μL于同一具塞試管中搖勻。將混合物在暗室室溫下放置60 min，于517nm處測定吸光度。結(jié)果見表3。(以上述所配置的溶液按照下述的方法每個實驗平行進(jìn)行三次，取其平均值，計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD。)</p><p>　　自由基清除率按照下面公式計算：清除率%=(對照+空白-樣品)/對照。</p><p>　　對照：1 mL

28、蒸餾水+1 mL乙醇+250 μL濃度為0.02 % DPPH 99.5 %乙醇溶液；</p><p>　　樣品：1 mL樣品+1 mL乙醇+250 μL濃度為0.02 % DPPH 99.5 %乙醇溶液；</p><p>　　空白：1 mL樣品+1 mL乙醇+250 μL乙醇。</p><p><b>　　3.3.3 還原力</b></

29、p><p>　　水解液還原力測定按照1988年Oyaizu[13]使用方法進(jìn)行。取2mL樣品溶液于試管中，依次加入2 mL0.2 mol/L (pH6.6) 磷酸鹽緩沖液、2 mL的1 %鐵氰化鉀溶液，充分混勻后在50 ℃保溫20 min，接著再加入2 mL10 % 的三氯乙酸（TCA）溶液，離心，取出2mL上清液于另一試管中，再加入2 mL蒸餾水和0.4 mL 0.1 %三氯化鐵溶液進(jìn)行反應(yīng)，10 min后于700

30、 nm處測定吸光度，吸光值越高表明還原力越高。結(jié)果見表4。(以上述配置的溶液每個實驗做三個平行組，取平均值，計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD。) </p><p>　　3.3.4羥自由基清除能力[14-16]</p><p>　　取1 mL濃度為0.75 mmol/L鄰二氮菲裝于試管中，再加入2 mL PBS(pH 7.4)，1 mL蒸餾水，完全混勻后，加入濃度為0.75 mmol/L的硫酸亞鐵1m

31、L，混勻，加1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.12%的H2O2，37 ℃水浴反應(yīng)90 min，于536 nm處測其吸光度，為Ap；用蒸餾水1 mL代替1 mL H2O2，為Ab；用樣品代替1mL的蒸餾水，為As。結(jié)果見表5。(以上述配置的溶液每個實驗做三個平行組，取平均值，計算其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD。)</p><p>　　樣品對羥自由基清除率按照下面公式計算：</p><p>　　樣品對羥自由基清除率

32、=(As-Ap)/(Ab-Ap)×100%</p><p>　　3.4雞胚絨毛尿囊膜實驗[17]</p><p><b>　　3.4.1實驗材料</b></p><p>　　待測的樣品由本實驗室制備；雞胚種蛋購買于蕭山雞場；定性濾紙、透明膠、新潔爾滅、75%乙醇等為本實驗室日常用品。</p><p>　　3.4

33、.2待測樣品制備</p><p>　　滅菌的定性濾紙作為樣品載體，濾紙先剪成大小約為4 mm × 4 mm的方塊，滅菌，冷卻后在無菌環(huán)境下滴加不同濃度的待測樣品，風(fēng)干放在潔凈區(qū)待用。</p><p><b>　　3.4.3蛋胚孵育</b></p><p>　　在室溫下，將雞胚種蛋浸沒于新潔爾滅水溶液10 min，擦干后將雞蛋氣室向上，

34、在溫度為(37.6士0.2) ℃，相對濕度為60 %的孵化箱孵化72 h。</p><p>　　3.4.4蛋胚氣室的去除</p><p>　　在孵化箱中孵育的第4天，將蛋胚放在超凈臺上用75 %乙醇消毒，用鑷子輕輕地在蛋胚頂端戳一小口，然后小心地去掉周圍的蛋殼和殼膜，使開口約為l5 mm × l5 mm大小。此時看到的氣室凹陷部隔著一層氣室膜就是CAM膜，同時也清楚地看到CAM膜

35、上網(wǎng)狀血管的大小和分布位置。在血管分叉較少的部位，用注射針頭慢慢地從氣室同卵黃分隔處挑破氣室膜，滴入1-2滴無菌水，將氣室膜與CAM膜分開，然后用鑷子小心夾去上層的氣室膜，暴露出下層的CAM膜。</p><p><b>　　3.4.5加樣</b></p><p>　　將3.4.2制備好的載樣濾紙置于CAM膜和卵黃囊膜處血管稀少的部位，然后用滅菌透明膠帶封嚴(yán)蛋口，繼續(xù)孵

36、育約48 h。樣品組為待測的不同濃度的樣品，陰性對照組為PBS，陽性對照組為4 µg的硫酸軟骨素（CS）。</p><p><b>　　3.4.6觀察</b></p><p>　　孵育結(jié)束后，用剪刀和鑷子輕輕地除去封嚴(yán)蛋口的透明膠，輕輕滴入甲醇/丙酮等體積混合液lmL，室溫下固定10min，慢慢地用鑷子將蛋殼從氣室端周圍揭去，最大程度的暴露雞胚絨毛尿囊膜，以

37、加樣點為中心，以半徑5mm間隔將CAM劃分為3個區(qū)域，拍照記錄實驗結(jié)果，結(jié)果如圖2，計數(shù)各區(qū)域的血管數(shù)，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析比較各劑量組與對照組之間的差異。結(jié)果如表6。</p><p>　　3.5離子交換層析[18]</p><p>　　3.5.1填料DEAE cellulose DE-52的處理</p><p>　　取配制好的0.5 mol/L氫氧化鈉溶液500 mL，撒

38、入30g DEAE cellulose DE-52，用玻璃棒攪拌混勻，室溫下放置2h（間歇輕微攪拌），倒去上清液，重復(fù)操作1次，水洗2次至中性，再用500mL 0.5mol/L鹽酸溶液處理2次（方法同上），水洗2次至中性。</p><p>　　3.5.2安裝和洗脫層析柱</p><p>　　選擇規(guī)格為2×100cm的層析柱，將柱頂端與恒流泵相連，柱底部與自動收集器相連，垂直安裝在

39、鐵架臺上。將處理好的DEAE cellulose DE-52和PBS充分?jǐn)噭?，用玻璃棒引流沿壁連續(xù)緩緩注入填料，最后用PBS灌滿柱剩下容積。啟動泵，PBS以2mL/min沖壓柱子直至柱體積恒定，用約2倍柱體積的PBS沖洗以平衡填料，流速為1mL/min。取500mg青鯊軟骨60%(NH4)2SO4沉淀蛋白樣品，溶解在10mL的PBS中，低溫高速離心機離心10min，轉(zhuǎn)速為10000 r/min，得上清液，約9mL上樣。分別以0.1mol

40、/L和0.5mol/L NaCl(PBS)溶液，分步洗脫2倍柱體積，流速1mL/min。每10mL收集一管。用紫外分光光度計在280nm處檢測，按峰合并。結(jié)果如圖3。將所得樣品4℃下透析過夜，冷凍干燥成粉，保存。計算洗脫率和蛋白產(chǎn)率，結(jié)果如表7。</p><p>　　3.5.3抗氧化活性測定</p><p>　　將冷凍干燥好的各洗脫峰樣品用PBS稀釋成濃度為5mg/mL的蛋白溶液。方法參照

41、3.3，比較各洗脫峰的抗氧化活性，選擇抗氧化能力強的洗脫峰蛋白做下一步純化。結(jié)果見表8。</p><p>　　3.5.4雞胚絨毛尿囊膜實驗</p><p>　　方法參照3.4。結(jié)果見圖4，表9。</p><p>　　3.6電泳實驗[19]</p><p>　　3.6.1制備電泳試劑</p><p>　　（1）低相對分子

42、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)含有6種已知相對分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)組合試劑(上海生物化學(xué)研究所)：按說明書要求開管分裝，即每個包裝加入200μL水充分溶解，然后分裝于20個小塑料離心管，-20℃保存。分裝后每份體積10μL，每種標(biāo)準(zhǔn)蛋白的含量為2μg，用時按下述待側(cè)樣品的加熱變性處理。</p><p>　?。?）待測蛋白質(zhì)樣品：取蛋白樣品0.5mg，加入0.01 mol/L磷酸緩沖液(pH=7.0)1mL溶解。以下同標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)一樣，

43、加入等體積的樣品緩沖液，混勻，在沸水浴中加熱3 min，待電泳時用于上樣。</p><p>　?。?）30%丙烯酰胺凝膠貯液：稱取29g無結(jié)塊的丙烯酰胺和1g甲叉雙丙烯酰胺，37℃水溶解，定容到100mL，濾去不溶物，裝入棕色瓶中，于4℃保存。</p><p>　　（4）1.5mol/L Tris(pH8.8)</p><p>　?。?）1.0mol/L Tris(

44、pH6.8)</p><p>　?。?）100g/L SDS：稱取SDS 10g，用50mL水溶解，加水至l00mL。</p><p>　?。?）電泳緩沖液(pH8.3) ×5：稱取Tris 3.78g、Gly 23.50g、SDS 1.25g，加水定容至250 mL，溶解，用時稀釋5倍。</p><p>　?。?）100g/L過硫酸銨溶液：取1g過硫酸銨

45、，加水溶解，并定容至10 mL，置4℃保存。</p><p>　　（9）TEMED(甲基乙二胺)</p><p>　?。?0）樣品緩沖液：稱取蔗糖2.5g、SDS 0.46g、Tris 0.15g、2-琉基乙醇 1 mL，用水定容至10 mL，加溴酚藍(lán)0.01g，使完全溶解。</p><p>　?。?1）染色液配制：1mol/L 鹽酸溶液(A)、1g/L 考馬斯亮藍(lán)

46、G250溶液(B)，應(yīng)用時用1 mL A液和15 mL B液混合加水至1000mL，攪拌混勻。</p><p>　　（12）脫色液1mmol鹽酸</p><p>　　3.6.2安裝灌膠架和配制電泳膠</p><p>　　按041BR型電泳儀說明書中描述的方法安裝灌膠架。取一個小錐形瓶配制分離膠溶液，按表1配制分離膠溶液。加入過硫酸銨后迅速、連續(xù)地灌注在兩塊玻板的間隙

47、中，高度距玻璃板上出口處約2cm。用帶有針頭的注射器小心地在丙烯酰胺溶液上部覆蓋一層水，在50℃下垂直放置15min左右，使其充分聚合凝固。傾去覆蓋層溶液，再用水輕輕沖洗頂部2次，棄去多余溶液。另用一個錐形瓶，按表1配制濃縮膠溶液，同樣一旦加入過硫酸銨，迅速灌在已聚合的分離膠的上端。隨即插入干凈的塑料梳子，趕去氣泡，梳齒前沿與分離膠間距離約為0.5cm。在50℃下使其完全凝固約10min。</p><p><

48、;b>　　表1電泳膠的制備</b></p><p><b>　　3.6.3加樣</b></p><p>　　輕輕將灌好膠的膠板從灌膠架上取下，放入電泳槽中，加入稀釋過的電泳緩沖液(pH8.3)至高出內(nèi)側(cè)玻板上緣約0.4cm。小心移出梳子不要破壞梳孔。用微量進(jìn)樣器抽取已處理好的標(biāo)準(zhǔn)蛋白和待測軟骨蛋白樣品液5µL，按順序，通過電泳緩沖液小心地把

49、樣品加在每個梳孔的底部凝膠面上。</p><p><b>　　3.6.4電泳</b></p><p>　　蓋好電泳槽蓋，接通電泳儀電源，電壓調(diào)至50V，樣品開始進(jìn)入濃縮膠中，逐漸被濃縮。當(dāng)溴酚藍(lán)指示劑剛要進(jìn)入分離膠時，迅速將電壓調(diào)至120V，繼續(xù)電泳直至指示劑接近分離膠底部，調(diào)電壓為零，切斷電源，電泳完畢。卸下電泳玻璃膠板，將膠板浸沒于水中，用鏟子小心撬開玻璃板，使兩

50、者分離，小心刮下分離膠。取出分離膠浸泡于5mmol/L鹽酸溶液中，振蕩約1h，進(jìn)行固定；棄去鹽酸溶液，將膠置于染色液中，連續(xù)振蕩染色約30分鐘；棄去染色液，小心的將膠置于1mmol/L鹽酸溶液中脫色10小時(換液3~5次)。最后輕輕取出凝膠進(jìn)行觀察和拍照，并將凝膠保存于1mmol/L鹽酸溶液中。應(yīng)用Quantity One System對凝膠進(jìn)行拍照，并作蛋白質(zhì)條帶染色強度分析，如圖5。</p><p>　　3.

51、7 Sephadex G-75凝膠過濾層析[20]</p><p>　　3.7.1填料Sephadex G-75凝膠的處理</p><p>　　稱取適量 Sephadex G-75，用大量水溶解，浸泡24h充分溶脹。</p><p>　　3.7.2安裝和洗脫層析柱</p><p>　　選擇2×120cm層析柱，柱上端接適宜大小的儲液

52、瓶，下端接自動部分收集器，垂直安裝在鐵架臺上。用玻璃棒沿壁連續(xù)緩緩注入填料Sephadex G-75凝膠，并用PBS灌滿層析柱，以2倍量柱體積的PBS平衡柱子，流速2mL/min。取140mg樣品，加適量PBS溶解調(diào)整濃度至20mg/mL，離心，上樣。PBS洗脫2倍柱體積，流速為1mL/min，每6mL收集一管。用紫外分光光度計在波長280nm處檢測，按峰合并。結(jié)果見圖6。冷凍干燥，保存。計算洗脫率和蛋白產(chǎn)率，結(jié)果如表10。</p

53、><p>　　3.7.3抗氧化活性測定</p><p>　　將冷凍干燥好的各洗脫峰樣品用PBS稀釋成濃度為5mg/mL的蛋白溶液。方法參照3.3比較各峰的抗氧化能力，選擇抗氧化能力強的凍干蛋白作高效液相色譜分析。結(jié)果見表11。</p><p>　　3.7.4高效液相分析</p><p>　　取0.5mg/mL樣品。流動相（20%乙腈、水、0.05

54、%TFA），過微孔濾膜上樣。結(jié)果見圖7。</p><p>　　3.7.5雞胚絨毛尿囊膜實驗</p><p>　　方法同3.5。結(jié)果見圖8。結(jié)果見表12。</p><p><b>　　3.7.6電泳實驗</b></p><p>　　方法同3.6。結(jié)果見圖9。</p><p><b>　　4

55、實驗結(jié)果與討論</b></p><p>　　4.1 (NH4)2SO4分級沉淀結(jié)果</p><p>　　4.1.1青鯊軟骨(NH4)2SO4分級沉淀結(jié)果 </p><p>　　制備得到60%(NH4)2SO4沉淀蛋白19.21克，提取率為0.74%，100%(NH4)2SO4沉淀蛋白13.27克，提取率為0.51%。</p><p&g

56、t;　　4.1.2蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線</p><p>　　在280nm處對不同濃度的牛血清蛋白測定吸光度，以蛋白濃度為橫坐標(biāo)，縱坐標(biāo)為280 nm處的吸光度值，繪制常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)定量曲線，對其做直線相關(guān)檢驗，標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1。</p><p>　　圖1 牛血白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線</p><p>　　由圖1可知，得到回歸方程為：A=0.6808C－0.05(R2 =0.9991)，該方程

57、在所測范圍內(nèi)（0.25～1.25mg/mL）線性關(guān)系良好。</p><p>　　4.1.3 青鯊軟骨60%(NH4)2SO4沉淀蛋白和100%兩部的含量和提取率</p><p>　　表 2 青鯊軟骨(NH4)2SO4沉淀的含量和提取率</p><p>　　(注：BSF60%代表青鯊軟骨60%(NH4)2SO4沉淀蛋白，BSF100%代表青鯊軟骨100%(NH4)2S

58、O4沉淀蛋白)</p><p>　　由表2可知，青鯊60%硫酸銨沉淀的蛋白質(zhì)含量與提取率均同時高于100%硫酸銨沉淀部分。由此可見，60%(NH4)2SO4能更好地奪取青鯊軟骨蛋白質(zhì)分子的水化層，使軟骨蛋白析出。</p><p>　　4.2 抗氧化活性測定結(jié)果</p><p>　　4.2.1 DPPH自由基清除能力的測定</p><p>　　

59、表 3 DPPH自由基清除率數(shù)值表</p><p>　　由表3可知，60%硫酸銨沉淀蛋白的DPPH自由基清除能力強于100%硫酸銨沉淀蛋白。</p><p>　　4.2.2 還原力的測定</p><p>　　表 4 還原力測定吸光度值表</p><p>　　由表4可知，60%硫酸銨沉淀蛋白鐵氰化鉀還原力強于100%硫酸銨沉淀蛋白。</p

60、><p>　　4.2.3 羥自由基清除能力的測定</p><p>　　表 5 羥基自由基清除率數(shù)值表</p><p>　　由表5可知，60%硫酸銨沉淀蛋白羥自由基清除能力強于100%硫酸銨沉淀蛋白。</p><p>　　根據(jù)綜上結(jié)果可知，60%硫酸銨沉淀蛋白的DPPH自由基清除能力、還原力、羥自由基清除能力均強于100%硫酸銨沉淀蛋白，因此選擇6

61、0%硫酸銨沉淀蛋白做下一步純化。</p><p>　　4.3雞胚絨毛尿囊膜實驗結(jié)果</p><p>　　4.3.1 BSF60%抑制雞胚絨毛尿囊膜CAM血管生成的測定</p><p>　　BSF60%組隨著蛋白濃度遞增，血管少且細(xì)。BSF60%對雞胚絨毛尿囊膜的血管抑制效果和統(tǒng)計學(xué)分析，如圖2和表6所示。</p><p>　　PBS

62、 CS BSF60%(1µg) BSF60%(4µg) BSF60%(8µg)</p><p>　　圖2加BSF60% 48h后CAM上的血管生成抑制效果</p><p>　　表6 加BSF60% 48h后CAM血管生成抑制效果的統(tǒng)計學(xué)分析</p><p>　　由表6可知，1µg 、4

63、µg 、8µg的BSF60%組對雞胚尿囊膜血管抑制率分別達(dá)到18.2%、29.6%、40.7%，同時蛋白濃度和血管抑制率有依賴關(guān)系。</p><p><b>　　4.4離子交換層析</b></p><p>　　4.4.1離子交換層析紫外檢測結(jié)果</p><p>　　分別用0.1mol/L和0.5mol/LNaCl（PBS）溶

64、液分步洗脫BSF60%，結(jié)果如圖3所示。</p><p>　　圖3 DEAE cellulose DE-52離子交換層析分步洗脫曲線</p><p>　　由圖3可知，60%硫酸銨沉淀蛋白經(jīng)離子交換層析得到三個峰，分別記為BSFL-1、BSFL-2、BSFL-3。比較所得三個峰，發(fā)現(xiàn)BSFL-3洗脫效果較好，故測定其洗脫率和蛋白產(chǎn)率。</p><p>　　4.4.2

65、離子交換層析蛋白洗脫率和蛋白產(chǎn)率</p><p>　　表7離子交換層析的洗脫率和蛋白產(chǎn)率</p><p>　?。ㄗⅲ罕碇蠦SFL代表青鯊離子交換層析洗脫的蛋白峰，離子交換洗脫率=洗脫后凍干蛋白/(NH4)2SO4沉淀蛋白；蛋白產(chǎn)率=洗脫后凍干蛋白/軟骨總重）</p><p>　　4.4.3青鯊軟骨離子交換層析各峰抗氧化能力</p><p>　

66、　表8青鯊軟骨離子交換層析抗氧化結(jié)果</p><p>　　由表8可知，BSFL-3的抗氧化能力明顯強于前兩個峰。因此，選擇BSFL-3做下一步純化。</p><p>　　4.4.4 BSFL-3抑制雞胚絨毛尿囊膜（CAM）血管生成的測定</p><p>　　BSFL-3組隨著蛋白濃度的升高，血管逐漸減少且比BSF60%組少，管徑也更細(xì)。BSFL-3對雞胚絨毛尿囊膜的

67、血管抑制效果和統(tǒng)計學(xué)分析，如圖4和表9所示。</p><p>　　PBS </p><p>　　PBS CS BSFL-3 (1µg) BSFL-3 (4µg) BSFL-3 (8µg)</p><p>　　圖4 加BS

68、FL-3 48h后CAM上的血管生成抑制效果</p><p>　　表9加BSFL-3 48h后CAM上的血管生成抑制效果的統(tǒng)計學(xué)分析</p><p>　　(注：BSFL-3代表通過離子交換層析洗脫下來的青鯊軟骨活性蛋白)</p><p>　　由表9可知，1 µg 、4 µg、8 µg的BSFL-3組對雞胚絨毛尿囊膜血管抑制率分別達(dá)到37

69、.6%、41.6%、43.3%，同時蛋白濃度和血管抑制率有依賴關(guān)系。</p><p><b>　　4.5電泳實驗</b></p><p>　　4.5.1離子交換層析電泳結(jié)果</p><p>　　BSF60%和BSFL-3的SDS-PAGE電泳結(jié)果如圖5所示。</p><p>　　1 2 M&l

70、t;/p><p>　　圖5 SDS-PAGE電泳結(jié)果圖</p><p>　?。ㄗⅲ河镜?，2分別為BSF60%、BSFL-3，泳道M為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)）</p><p>　　由圖5可知，泳道1的條帶分部平均，所以BSF60%的分子量分布比較平均。泳道2的條帶主要集中在上半部，下邊也有幾條比較淺的蛋白條帶，所以說明BSFL-3蛋白的分子量較大。</p><p

71、>　　4.6 Sephadex G-75凝膠過濾層析</p><p>　　4.6.1凝膠過濾層析紫外檢測結(jié)果</p><p>　　BSFL-3過SephadexG-75凝膠組層析洗脫曲線結(jié)果如圖6所示。</p><p>　　圖6 Sephadex G-75 凝膠過濾層析洗脫曲線</p><p>　　由圖6可知，Sephadex G-75

72、 凝膠過濾層析洗脫BSFL-3過后，為一個單一峰，記作BSFN。</p><p>　　4.6.2青鯊軟骨蛋白(BSFN)凝膠洗脫率和蛋白產(chǎn)率</p><p>　　表10凝膠層析蛋白的洗脫率和蛋白產(chǎn)率</p><p>　?。ㄗⅲ罕碇蠦SFN代表青鯊Sephadex G-75 凝膠柱層析洗脫的蛋白峰，凝膠層析洗脫率=凝膠層析蛋白/離子交換蛋白；蛋白產(chǎn)率=洗脫后凍干蛋白/

73、軟骨總重）</p><p>　　4.6.3青鯊軟骨蛋白BSFN抗氧化能力結(jié)果</p><p>　　表11青鯊軟骨BSFN抗氧化能力結(jié)果</p><p>　　由表11可知，BSFN的濃度和抗氧化能力有依賴性，且抗氧化活性比粗品強。</p><p>　　4.6.4青鯊軟骨蛋白(BSFN)的高效液相分析</p><p>　　

74、取過Sephadex G-75的蛋白(BSFN)0.5 mg。溶于1 mL流動相（20%乙腈、水、0.05%TFA）中。過0.45 µm微孔濾膜，上樣。流動相流速為0.5 mL/min，結(jié)果如圖7所示。</p><p>　　圖7 BSFN過 Shim-pack VP-ODS柱反相高效液相色潽圖</p><p>　　由圖7可知，BSFN經(jīng)過高效液相分析為單一峰，說明青鯊軟骨蛋白BS

75、FN為單一物質(zhì)。</p><p>　　4.6.5 BSFN抑制雞胚絨毛尿囊膜（CAM）血管生成的測定</p><p>　　BSFN對血管數(shù)隨濃度升高而大量減少。BSFN對雞胚絨毛尿囊膜的血管抑制效果和統(tǒng)計學(xué)分析，如圖8和表12所示。</p><p>　　PBS CS BSFN (1µg)

76、BSFN (4µg) BSFN (8µg)</p><p>　　圖8 加BSFN 48h后CAM上的血管生成抑制效果</p><p>　　表12加BSFN 48后CAM上BSFN的血管生成抑制效果的統(tǒng)計學(xué)分析</p><p>　　由表12可得，1µg的BSFN對雞胚絨毛尿囊膜的抑制率達(dá)到68.8%，4µg時抑制

77、率為81.1%，升高到8µg時抑制率為89.4%。BSFN能顯著抑制雞胚絨毛尿囊膜新生血管的生成，并且抑制效果具有一定的濃度依賴性。</p><p>　　4.6.6青鯊軟骨蛋白(BSFN)的電泳結(jié)果</p><p>　　BSFN的SDS-PAGE電泳結(jié)果如圖9所示。</p><p>　　1 M</p><p>　　

78、圖9 BSFN的SDS-PAGE電泳結(jié)果圖</p><p>　　（注：泳道1為BSFN，泳道M為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)）</p><p>　　由圖9可知，考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果為一條帶，說明BSFN以達(dá)到電泳純，根據(jù)Maker的遷移率，測得其分子量約為95.8 kDa，經(jīng)查閱，沒有獲取同種蛋白質(zhì)的資料，說明從青鯊軟骨中分離獲得的BSFN可能是一種結(jié)構(gòu)新穎的活性蛋白。</p><p&g

79、t;<b>　　5結(jié)論</b></p><p>　　5.1硫酸銨分級沉淀</p><p>　　青鯊軟骨經(jīng)過 (NH4)2SO4分級沉淀后，60%的硫酸銨沉淀蛋白的提取率為0.73%，100%部分的為0.51%。60%的硫酸銨沉淀部分的提取率明顯高于100%的硫酸銨沉淀部分。結(jié)果說明60%的硫酸銨能更充分的使軟骨中的蛋白生成沉淀，同時說明軟骨中的蛋白可能大部分集中在這個

80、分子量的范圍里。</p><p><b>　　5.2柱層析方法</b></p><p>　　通過DEAE cellulose DE-52離子交換層析和Sephadex G-75凝膠層析對青鯊軟骨粗蛋白進(jìn)行分離純化，獲得了青鯊軟骨血管生成抑制因子（BSFN）。12%的SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，考馬斯亮藍(lán)染色為一條帶，說明達(dá)到電泳純，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率，測得其分子

81、量為95.9kDa。目前國內(nèi)尚未見獲取同種蛋白質(zhì)的報道，所以BSFN可能是一種具有新穎結(jié)構(gòu)的活性蛋白。</p><p>　　5.3抗氧化活性研究</p><p>　　本實驗發(fā)現(xiàn)青鯊軟骨蛋白的濃度和抗氧化活性呈現(xiàn)良好的量效關(guān)系，且純化后的軟骨蛋白具有很強的抗氧化能力。由于氧自由基的毒性作用可以引發(fā)機體的多種疾病，如心血管疾病、炎癥、腫瘤、衰老，故本實驗的研究對疾病的防治及機體抗衰老有著重要的

82、意義。</p><p>　　5.4新生血管生成抑制因子</p><p>　　本文主要從新生血管抑制因子的角度對青鯊軟骨蛋白進(jìn)行研究。通過改進(jìn)的雞胚絨毛尿囊膜模型對其軟骨粗蛋白、純化蛋白進(jìn)行體外活性實驗，經(jīng)過統(tǒng)計學(xué)分析8µg的BSF60%對雞胚尿囊膜血管抑制率達(dá)到40.7%，8µg的BSFL-3對雞胚尿囊膜血管抑制率達(dá)到43.3%，4µg時BSFN的抑制率為74

83、.3%，升高到8µg時抑制率為80.9%。結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著蛋白濃度的升高新生血管抑制作用也明顯升高，且純化后的蛋白對新生血管生成的抑制作用非常明顯。這說明青鯊軟骨具有較強新生血管生成抑制作用。因此它可以作為一種有效的新生血管抑制劑為腫瘤的治療和研究提供新的選擇，并且為進(jìn)一步在分子水平研究其腫瘤抑制機理提供了理論基礎(chǔ)。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)</b></p>

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