蘋(píng)果MdCIPK6的基因克隆及其在逆境脅迫響應(yīng)中的作用.pdf

1、鈣調(diào)磷酸酶B類蛋白（calcineurin B-like proteins，CBLs）是近年來(lái)鑒定出的一類植物中特有的Ca2+傳感器，與其互作的蛋白CIPK（CBL-interacting protein kinase）一起在植物特定的生長(zhǎng)發(fā)育和應(yīng)答脅迫過(guò)程中起重要作用。研究表明，CIPK廣泛參與植物對(duì)高鹽、干旱和低溫等非生物脅迫的應(yīng)答反應(yīng)。目前對(duì)于CIPK的研究主要集中在擬南芥，水稻上等少數(shù)模式植物上，對(duì)于果樹(shù)方面研究甚少。由于多方面

2、的原因，可用來(lái)耕種的土地越來(lái)越少，同時(shí)由于世界范圍內(nèi)氣候的變化，果樹(shù)的種植面積和范圍將嚴(yán)重的受到影響。挖掘蘋(píng)果CIPK基因并進(jìn)行功能研究，不但具有重要的理論意義，而且具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值，可以為果樹(shù)抗逆轉(zhuǎn)基因育種提供潛在的有效候選基因。本研究從蘋(píng)果中克隆到一個(gè)CIPK基因MdCIPK6，并對(duì)其基因結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，表達(dá)特異性及其功能等進(jìn)行了分析。主要研究工作與結(jié)果如下：
　　 1.利用RACE的方法，克隆得到MdCIPK6全長(zhǎng)cDNA，總

3、長(zhǎng)度為1565bp，其中ORF區(qū)為1299bp，編碼一條含433個(gè)氨基酸的多肽，預(yù)測(cè)的PI為8.98，分子量為48.50 kDa。蛋白結(jié)構(gòu)上具有CIPK所共有的N端激酶結(jié)構(gòu)域和C端NAF保守結(jié)構(gòu)域。
　　 2.半定量RT-PCR結(jié)果表明，它在各個(gè)組織和器官中組成型表達(dá)，而在根中的表達(dá)量相對(duì)較低。但是，用NaCl和ABA處理嘎啦生根組培苗，發(fā)現(xiàn)MdCIPK6明顯在根中受到誘導(dǎo)表達(dá)。此外，在非生物逆境脅迫，激素以及外源Ca2+處理下

4、，都能明顯誘導(dǎo)其表達(dá)。說(shuō)明MdCIPK6基因有可能在抗逆脅迫響應(yīng)中有重要作用。
　　 3.酵母雙雜試驗(yàn)表明，MdCIPK6能夠和擬南芥的AtCBL4（AtSOS3）蛋白相互作用；功能互補(bǔ)試驗(yàn)結(jié)果表明，MdCIPK6和MdCIPK6T175D能夠部分互補(bǔ)擬南芥sos2突變體抗鹽方面的功能。在野生型中擬南芥過(guò)量表達(dá)MdCIPK6和MdCIPK6T175D能夠明顯提高抗逆性。說(shuō)明MdCIPK6部分通過(guò)SOS途徑調(diào)控抗逆性。
　　

5、 4.為了鑒定MdCIPK6基因在蘋(píng)果抗逆性（如抗鹽、抗旱和抗冷等）中的功能，進(jìn)行了蘋(píng)果轉(zhuǎn)基因研究，結(jié)果表明，與野生型和反義轉(zhuǎn)基因株系相比，過(guò)量表達(dá)MdCIPK6和MdCIPK6T175D能夠明顯提高蘋(píng)果的抗逆性，表明MdCIPK6是蘋(píng)果抗逆性的正調(diào)控因子。
　　 5.為了進(jìn)一步鑒定MdCIPK6基因在作物中的功能，在番茄中過(guò)量表達(dá)了MdCIPK6基因，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因番茄在萌發(fā)、幼苗和成苗期的抗逆性均明顯提高，說(shuō)明MdCIP