硫酸化絲素蛋白復(fù)合管狀支架制備方法及其性能的研究

1、<p>　　單位代碼 10006 </p><p>　　學(xué) 號 10101023 </p><p>　　1分類號 R318.08 </p><p><b>　　畢業(yè)設(shè)計(論文)</b></p><p>　　硫酸化絲素蛋白復(fù)合管狀

2、支架制備方法</p><p><b>　　及其性能的研究</b></p><p><b>　　2014年6月</b></p><p><b>　　北京航空航天大學(xué)</b></p><p>　　本科生畢業(yè)設(shè)計（論文）任務(wù)書</p><p>　?、?、畢業(yè)設(shè)計

3、（論文）題目：</p><p>　　硫酸化絲素蛋白復(fù)合管狀支架制備方法及其性能的研究 </p><p>　?、?、畢業(yè)設(shè)計（論文）使用的原始資料（數(shù)據(jù)）及設(shè)計技術(shù)要求：</p><p>　　本實(shí)驗(yàn)的目標(biāo)是研究硫酸化絲素蛋白復(fù)合管狀支架的制備方法，并考察支架的抗?jié)B透性、抗凝血性和力學(xué)性能。原始資料和具體的技術(shù)要求如下：

4、 </p><p>　　采用涂覆凝膠法制備復(fù)合管狀支架，在編織的絲素蛋白管狀支架表面涂覆由硫酸化絲素蛋白溶液和聚乙二醇二縮水甘油醚（PGDE）混合冷凍形成的凝膠。利用PGDE增強(qiáng)凝膠的柔順性[1-3]。

5、 </p><p>　　使用氯磺酸在絲素蛋白的Ser殘基側(cè)鏈上引入硫酸基團(tuán)制造出類似肝素的結(jié)構(gòu)，從而賦予絲素蛋白更強(qiáng)的抗凝血作用[4,5]。研究結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)制備的硫酸化絲素蛋白其抗凝血活性遠(yuǎn)高于表面共價結(jié)合肝素的聚氨酯（PU）、聚對苯二甲酸乙二醇酯（PET）等材料。

6、 </p><p>　　小口徑人工血管對力學(xué)性能和抗?jié)B透性的要求非常高，本實(shí)驗(yàn)主要測試的性能包括拉伸強(qiáng)度、縫合強(qiáng)度、順應(yīng)性和抗?jié)B透性等。 </p><p>　　最后，硫酸化絲素蛋白復(fù)合管狀支架的動物實(shí)驗(yàn)由校外的合作單位（昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院）進(jìn)行，選擇比格

7、犬作為實(shí)驗(yàn)動物。 </p><p>　?、蟆厴I(yè)設(shè)計（論文）工作內(nèi)容：</p><p>　　1．查閱文獻(xiàn)，并翻譯2萬字； </p><p

8、>　　2．探究硫酸化絲素蛋白復(fù)合管狀支架的制備方法 ; </p><p>　　3．制備硫酸化絲素蛋白復(fù)合管狀支架（理化性能，形貌觀察）； </p><p>　　4．血管支架性能的研究，包括拉伸強(qiáng)度、縫合強(qiáng)度、抗?jié)B透和順應(yīng)性等性能的測定；

9、 </p><p>　　5．進(jìn)行動物實(shí)驗(yàn)并得到初步結(jié)果； </p><p>　　6．撰寫論文，結(jié)題答辯。 &l

10、t;/p><p><b>　　Ⅳ、主要參考資料：</b></p><p>　　[1] Min SJ, Gao X, Han CM, Chen Y, Yang MY, Zhu LJ, et al. Preparation of a Silk Fibroin Spongy Wound Dressing and Its Therapeutic Efficiency in Ski

11、n Defects[J]. Journal of Biomaterials Science 23 (2012) 97–110. </p><p>　　[2] Min SJ, Gao X, Liu L, Tian L, Zhu LJ, Zhang HP, et al. Fabrication and Characterizatio

12、n of Porous Tubular Silk Fibroin Scaffolds[J]. Journal of Biomaterials Science 20 (2009) 1961–1974. </p><p>　　[3] Yagi T, Sato M, Nakaza

13、wa Y, Tanaka K, Sata M, Itoh K, et al. Preparation of double-raschel knitted silk vascular grafts and evaluation of short-term function in a rat abdominal aorta[J]. J Artif Organs (2011) 14:89–99.

14、 </p><p>　　[4] Tamada Y. Sulfation of silk fibroin by sulfuric acid and anti-coagulant activity[J]. J Appl Polym Sci. 2003, 87: 2377-2382.

15、 </p><p>　　[5] Tamada Y. Sulfation of silk fibroin by chlorosulfuric acid and anti-coagulant activity. Biomaterials. 2004, 25: 377-383. <

16、/p><p>　　生物與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院 院（系） 生物工程 專業(yè)類 101011 班</p><p>　　學(xué)生 鄒同強(qiáng) </p><p>　　畢業(yè)設(shè)計（論文）時間： 自 2014 年 3 月 1 日至 2014 年 5 月 25 日</p><p>　　答辯時間： 2014 年 6 月 10 日</p&

17、gt;<p>　　成績 </p><p>　　指導(dǎo)教師： </p><p>　　兼職教師或答疑教師（并指出所負(fù)責(zé)部分）：</p><p>　　系（教研室） 主任（簽字） </p><p><b>　　本人聲明</b&g

18、t;</p><p>　　我聲明，本論文及其研究工作是由本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下獨(dú)立完成的，在完成論文時所利用的一切資料均已在參考文獻(xiàn)中列出。</p><p><b>　　作者：鄒同強(qiáng)</b></p><p><b>　　簽字：</b></p><p>　　時間：2014年 6 月</p>&

19、lt;p>　　硫酸化絲素蛋白復(fù)合管狀支架制備方法及其性能的研究</p><p>　　學(xué) 生：鄒同強(qiáng) </p><p><b>　　指導(dǎo)教師：劉海峰</b></p><p><b>　　摘 要</b></p><p>　　小口徑人工血管研究面臨的主要問題包括急性血栓形成、內(nèi)膜增生

20、和力學(xué)強(qiáng)度不足等。在之前的研究中我們通過靜電紡絲、浸蘸溶液或模型制備等方法已經(jīng)制備出了多種絲素蛋白（SF）管狀支架，然而，采用這些方法制備的絲素蛋白管狀支架的力學(xué)性能尤其是柔順性仍需進(jìn)一步提高。在本實(shí)驗(yàn)中，我們制備了一種新型的硫酸化絲素蛋白復(fù)合管狀支架。該復(fù)合管狀支架由編織的絲素蛋白管狀支架和表面修飾的多孔凝膠組成，多孔凝膠由硫酸化絲素蛋白（S-SF）溶液與聚乙二醇二縮水甘油醚（PGDE）在-20條件下冷凍形成。與以往報道的絲素蛋白管狀

21、支架相比，本實(shí)驗(yàn)采用編織的絲素蛋白管狀支架作為結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)增強(qiáng)了支架的力學(xué)強(qiáng)度，覆蓋在表面的多孔凝膠既能增強(qiáng)支架的抗?jié)B透性，又能提高編織的絲素蛋白管狀支架的順應(yīng)性。動物實(shí)驗(yàn)的初步結(jié)果表明該復(fù)合管狀支架的順應(yīng)性良好，與天然動脈能夠較好地吻合，手術(shù)操作方便，移植后不會出現(xiàn)漏血現(xiàn)象，避免了急性血栓的形成?？傊?，利用硫酸化絲素蛋白多孔凝膠修飾編織的絲素蛋白管狀支架制備的小口徑人工血管既具有良好的抗凝血性和抗?jié)B透性，又具有足夠的力學(xué)強(qiáng)度，是一種極具應(yīng)

22、用前景的小口徑血管移植物。</p><p>　　關(guān)鍵詞：硫酸化絲素蛋白，小口徑人工血管，管狀支架，多孔凝膠，力學(xué)性能 </p><p>　　Preparation and properties of combined sulfated silk fibroin</p><p>　　tubular scaffolds </p><p>　　Au

23、thor :ZOU Tong-qiang</p><p>　　Tutor :LIU Hai-feng</p><p><b>　　Abstract</b></p><p>　　The major barriers for the development of small-diameter vascular grafts include the

24、risk of thrombosis, intimal hyperplasia, and mechanical failure. Silk fibroin (SF) tubular scaffolds have been prepared by many methods such as electrospinning, dipping, or molding. However, the mechanical properties of

25、SF tubular scaffolds prepared by these methods cannot meet the clinical requirements. In the present study, a novel combined sulfated silk fibroin (S-SF) tubular scaffold was developed by forming</p><p>　　Ke

26、y words: Sulfated silk fibroin, Small-diameter vascular grafts , Tubular scaffold, Porous gel, Mechanical properties</p><p><b>　　緒論</b></p><p><b>　　研究背景及目的</b></p>

27、<p>　　心腦血管疾病已經(jīng)成為了威脅人類健康的第一殺手。21世紀(jì)初，全世界每年約有1700萬人死于心腦血管疾病，到2020年死亡人數(shù)預(yù)計將達(dá)到2500萬人[1]。而血管重建是心腦血管疾病治療的一種重要方法，在臨床外科中占據(jù)著十分重要的地位。據(jù)不完全統(tǒng)計，全球每年大約有超過60萬病人需要接受各種血管外科手術(shù)，其中絕大部分病人都需要合適的血管移植物[2]。目前，已經(jīng)應(yīng)用于臨床的血管移植物主要包括自體血管、異體血管和人工合成材料

28、血管。然而，自體血管和異體血管都存在著許多不可避免的問題，如自體血管來源極其有限，供區(qū)犧牲較大，且自體靜脈在高壓力作用下容易產(chǎn)生血栓、內(nèi)膜增生和動脈硬化等問題；異體血管會出現(xiàn)排斥反應(yīng)、內(nèi)皮細(xì)胞脫落、與白細(xì)胞反應(yīng)和血管活性易喪失等問題。這些不可避免的問題大大限制了自體血管和異體血管在臨床上的應(yīng)用。在人工合成材料血管方面，滌綸（Dacron）和膨化聚四氟乙烯（ePTFE）是目前應(yīng)用最多的合成材料，臨床上替代大中動脈已經(jīng)取得滿意的效果，但其在

29、替代小口徑血管（直徑小于6mm）方面存在許多問題，最為嚴(yán)重的問題是容易形成血栓。研究表明術(shù)后兩年ePTFE人工血管移植物的通暢率僅為30%，因而</p><p>　　本實(shí)驗(yàn)的目的是研究硫酸化絲素蛋白復(fù)合管狀支架（以下簡稱復(fù)合管狀支架）的制備方法，并考察復(fù)合管狀支架的性能。通過對其性能的評估，確定出一套最優(yōu)的復(fù)合管狀支架制備方法，并詳細(xì)研究出采用該種方法制備的復(fù)合管狀支架的各種性能，如表面形態(tài)結(jié)構(gòu)，水滲透性，拉伸強(qiáng)

30、度等。最終，通過動物實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)復(fù)合管狀支架在體內(nèi)的生物學(xué)表現(xiàn)，評估復(fù)合管狀支架在體內(nèi)的抗凝血性。</p><p><b>　　研究現(xiàn)狀分析</b></p><p>　　目前，在人體血管重建手術(shù)中大口徑的人工血管已獲得令人滿意的臨床療效，而用于替代人體小口徑動脈和靜脈的小口徑人工血管（直徑＜6mm）在實(shí)驗(yàn)中卻一直未獲得滿意的效果[2]。因而，小口徑人工血管的研究與開發(fā)成為

31、了國內(nèi)外近數(shù)十年來血管支架領(lǐng)域的一個熱點(diǎn)。然而令人遺憾的是，到目前為止，還沒有一種小口徑人工血管移植物進(jìn)入到臨床測試階段，這是因?yàn)樾】趶饺斯ぱ苤踩塍w內(nèi)后容易激活機(jī)體凝血過程，形成血栓，導(dǎo)致新生內(nèi)膜的超常增生，造成管腔狹窄，甚至閉塞，遠(yuǎn)期通暢率不高，最終導(dǎo)致臨床移植失敗[6]。這些問題都迫使人們努力尋找構(gòu)建理想小口徑人工血管的新方法。</p><p>　　當(dāng)前制造小口徑人工血管支架的材料多為具有良好生物性能的人工

32、合成高分子材料和天然材料。人工合成高分子材料主要有兩種，一種是不可降解的材料，如尼龍（Nylon）、膨化聚四氟乙烯（ePTFE），滌綸（Dacron）和聚酯（PU）等；另一種是可降解材料，如聚乳酸(PLA)、聚左旋乳酸（PLLA）、聚乙醇酸（PGA）及其與其他多聚體形成的共聚體等。天然材料則主要包括去細(xì)胞基質(zhì)、多肽、聚氨基酸、膠原蛋白、透明質(zhì)酸和蠶絲等大分子材料。</p><p>　　對于人工合成高分子材料，其在

33、力學(xué)強(qiáng)度方面能夠滿足血管支架的強(qiáng)度要求，但是在生物相容性、遠(yuǎn)期通暢性和抗血栓形成等方面卻存在著天然的缺陷，往往不能單獨(dú)用于制備小口徑人工血管。研究已經(jīng)證實(shí)了滌綸（Dacron）和膨化聚四氟乙烯（ePTFE）在重建小口徑血管時會激活體內(nèi)凝血過程形成血栓，導(dǎo)致管腔狹窄或閉塞，最終使得臨床移植失敗。而聚乳酸、聚乙醇酸等植入人體后會逐步降解，材料降解率和組織生成率之間的平衡很難把握。因而，單獨(dú)使用一種人工合成高分子材料難以制備出滿足臨床要求的小

34、口徑人工血管。據(jù)此，研究者將研究重點(diǎn)轉(zhuǎn)向合成材料的改性、修飾和復(fù)合等方面。Jeschke等使用碳處理的聚氨酯血管支架進(jìn)行動物實(shí)驗(yàn)，ePTFE血管支架作為對照組，對比結(jié)果表明前者在更短的時間內(nèi)發(fā)生了內(nèi)皮化，且新生內(nèi)膜厚度較后者更薄[7]。Zhu等使用殼聚糖和肝素對ePTFE進(jìn)行表面修飾，體外血液相容性實(shí)驗(yàn)表明修飾后的ePTFE能夠明顯抑制血小板的粘附，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了修飾后的ePTFE移植到體內(nèi)后能夠保證較長時間的通暢[8]。Rand

35、one等使用細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（VEGF）處理ePTFE，研究結(jié)果表</p><p>　　對于天然材料，其在生物相容性、生物降解性和改性修飾等方面具有明顯的優(yōu)勢，但是其在力學(xué)強(qiáng)度方面往往達(dá)不到血管支架的要求。因此，研究者利用天然材料易改性和修飾的特點(diǎn)對其進(jìn)行力學(xué)強(qiáng)度的增強(qiáng)。研究者通過修飾膠原蛋白的纖維取向，增加膠原蛋白的密度和含量，創(chuàng)造新的交聯(lián)技術(shù)等方法大大提高了以膠原蛋白為結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)的血管

36、支架的力學(xué)強(qiáng)度[16-18]。Seliktar等利用動態(tài)機(jī)械刺激增強(qiáng)了細(xì)胞介導(dǎo)的膠原蛋白血管支架的結(jié)構(gòu)重塑，提高了支架的力學(xué)性能[19]。盡管膠原蛋白血管支架的力學(xué)強(qiáng)度能夠通過修飾得到提高，但是膠原蛋白在彈性方面天然不足，導(dǎo)致血管支架順應(yīng)性較差。因而，很多研究者研究了使用纖連蛋白凝膠提高血管支架彈性的可行性，結(jié)果表明纖連蛋白能夠大大增強(qiáng)血管支架的彈性[20-23]。但是，以纖連蛋白為基礎(chǔ)的血管支架力學(xué)強(qiáng)度依然不夠，Swartz等將平滑肌

37、細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞種植培養(yǎng)在纖連蛋白血管支架上解決了力學(xué)強(qiáng)度不夠這一難題，植入體內(nèi)15周后依然保持通暢[21]。Syedain等利用拉伸-剪切生物反應(yīng)器制備出了一種纖連蛋白動脈移植物，該種移植物與天然動脈具有相似的力學(xué)特征[24]。脫細(xì)胞基質(zhì)（ECM）也常常作為</p><p>　　而作為最早被人們發(fā)現(xiàn)、利用的天然高分子材料——蠶絲，由于其力學(xué)性能優(yōu)良，同時在生物相容性方面又明顯優(yōu)于各種傳統(tǒng)的人工合成高分子材料，因而

38、成為了組織工程領(lǐng)域令人關(guān)注的一類特殊的生物材料。其主要成分絲素蛋白含量約占蠶絲的70％～80％，含有18種氨基酸，其中甘氨酸(gly)、丙氨酸(ala)和絲氨酸(ser)約占總組成的80％以上[28]。蠶絲絲素蛋白作為組織工程基質(zhì)支架能夠滿足支架材料所需的力學(xué)性能和生物學(xué)性能，可用于各種組織工程學(xué)研究，如骨、韌帶、跟腱、血管和軟骨等等[29-32]。更為重要的是絲素蛋白具有抗血栓形成的表面性質(zhì)，在血管組織工程領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用前景。Ka

39、plan等應(yīng)用靜電紡絲技術(shù)制備出了一種絲素蛋白納米纖維的小口徑組織工程血管支架，研究結(jié)果表明該支架具有良好的力學(xué)性能和良好的生物相容性，能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞在支架上的粘附、生長和增值并保持細(xì)胞的表型[33,34]。Soffer等人研究表明采用絲素蛋白為材料制備的小口徑血管支架具有良好的機(jī)械性能[35]。Marelli等采用靜電紡絲法制備出順應(yīng)性良好的小口徑人工血管，并采用覆蓋多孔絲素蛋白凝膠的方法增強(qiáng)了靜電紡</p&g

40、t;<p>　　絲素蛋白分子中含有許多由6種氨基酸殘基(Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ser-)交替排列的結(jié)構(gòu)。其中，在Ser殘基上可以較為方便地引入硫酸基團(tuán)，進(jìn)而制造出類似肝素的結(jié)構(gòu)，而肝素分子中的葡糖胺單元含有的-NH-SO3-基團(tuán)具有明顯的抗凝血作用，因而引入硫酸基團(tuán)將極大程度地賦予絲素蛋白抗凝血作用。研究結(jié)果已經(jīng)證實(shí)了硫酸改性絲素蛋白的抗凝性比未改性絲素蛋白的抗凝性明顯增強(qiáng)。Yasushi等研究表明使用氯

41、磺酸代替濃硫酸制備的硫酸化絲素蛋白，其抗凝血活性提高了約100倍，活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于表面共價結(jié)合肝素的聚氨酯（PU）、聚對苯二甲酸乙二醇酯（PET）等材料[38,39]。Liu等采用靜電紡絲法研究并制備了硫酸化絲素蛋白組織工程支架，該支架具有良好的生物相容性和順應(yīng)性，且能夠支持內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的黏附、生長和增殖[40]。</p><p>　　除了使用靜電紡絲法將絲素蛋白制成小口徑人工血管外，許多研究者利用紡織的方法

42、直接制備出小口徑人工血管。Voorhees博士在1952 年的一次實(shí)驗(yàn)中創(chuàng)造了紡織基人工血管，Voorhees的研究將維綸制成人工血管，改變以往人工血管管壁的無通透性，這種帶有網(wǎng)孔的人工血管的研制是血管代用品發(fā)展史上的一個里程碑。人工血管經(jīng)過60多年的發(fā)展，其管壁結(jié)構(gòu)已從單一的機(jī)織逐步發(fā)展到機(jī)織、針織、編織、非織造及復(fù)合法等多種形態(tài)。對應(yīng)的人工血管的強(qiáng)度、順應(yīng)性、空隙率、厚度等物理機(jī)械性能則各不相同，分別適用于不同的人體器官移植。最早商

43、品化生產(chǎn)的人工血管采用了平紋組織，并一直沿用至今。由于機(jī)織平紋人工血管管壁結(jié)構(gòu)緊密、穩(wěn)定且變形小，適用于血流速度較高的位置，如胸主動脈，或用于患有血液凝結(jié)機(jī)制損傷的患者[41]。平紋織物相對易獲得較高的緊密度，從而具有最小的血滲透率，植入前無需預(yù)凝，適用于各種緊急情況中，如急需減少血液流失的主動脈瘤切除手術(shù)等。但這種組織結(jié)構(gòu)的負(fù)面特征表現(xiàn)為血管剛度大、硬度高和易散邊，造成手術(shù)不易操作和縫合困難[42]。此外，此類血管的順應(yīng)性較小，與宿主

44、血管的順應(yīng)性差異較大，會導(dǎo)致縫合線處的應(yīng)力集中</p><p>　　紡織基人工血管在順應(yīng)性和抗?jié)B透性兩方面是相互矛盾的，機(jī)織平紋人工血管抗?jié)B透性好、順應(yīng)性差，而針織和編織人工血管則是順應(yīng)性好、抗?jié)B透性差。對于順應(yīng)性和抗?jié)B透性這兩個方面，顯然，改變機(jī)織平紋人工血管的順應(yīng)性而使其滿足血管支架順應(yīng)性的要求是難以實(shí)現(xiàn)的，而改變針織和編織人工血管的抗?jié)B透性卻是比較容易實(shí)現(xiàn)的。目前，提高編織小口徑人工血管滲透性的方法主要是對

45、其內(nèi)外表面進(jìn)行包被處理，封堵編織管上存在的空隙。研究者將編織人工血管支架反復(fù)蘸取絲素蛋白溶液并烘干，獲得具有良好抗?jié)B透性的小口徑血管支架。但是，這種方法得到的小口徑人工血管過硬，進(jìn)行動物實(shí)驗(yàn)時與天然血管在順應(yīng)性方面失配，導(dǎo)致動物實(shí)驗(yàn)的操作難度大大提高，使得動物實(shí)驗(yàn)難以進(jìn)行。即使成功進(jìn)行動物實(shí)驗(yàn)，也會因?yàn)轫槕?yīng)性不匹配導(dǎo)致內(nèi)膜增生，進(jìn)而出現(xiàn)內(nèi)腔狹窄甚至閉塞，最終失敗。因而，許多研究者將研究方向轉(zhuǎn)向在編織人工血管的內(nèi)外表面包被多孔凝膠物，使編

46、織小口徑人工血管對血液保持足夠的抗?jié)B透性，從而避免失血過多。因此，研究的重點(diǎn)就是如何在編織人工血管內(nèi)外表面形成這層多孔的凝膠結(jié)構(gòu)，該層多孔凝膠的柔順性一定要好，這樣才能既保證編織小口徑血管的順應(yīng)性不被破壞，又能增</p><p>　　近期關(guān)于如何增強(qiáng)絲素蛋白凝膠順應(yīng)性的研究已有大量的報道。Min等采用聚乙二醇二縮水甘油醚（PGDE）與絲素蛋白溶液混合后-20°C冷凍形成多孔而有彈性的薄膜敷料，用于修復(fù)皮

47、膚損傷[45]。Min等還采用PGDE與絲素蛋白溶液形成多孔凝膠，覆蓋在絲素蛋白管狀支架上制成多孔支架，并檢驗(yàn)了支架材料的生物相容性[46]。Sato等將PGDE與絲素蛋白溶液形成的多孔凝膠層覆蓋在靜電紡絲絲素蛋白管上并測定了其各項(xiàng)性能[47]。但是，將多孔凝膠層與編織的絲素蛋白管狀支架聯(lián)合起來制備絲素蛋白復(fù)合管狀支架的研究報道較少，而關(guān)于其各項(xiàng)力學(xué)性能參數(shù)的研究報道更是少之又少。</p><p>　　目前，已有

48、許多研究者報道了各種小口徑人造血管的性能研究方法，對本課題研究具有重要的指導(dǎo)意義。Roeder等報道了SIS作為小口徑血管移植物的順應(yīng)性，彈性模量和爆破壓等參數(shù)，具體的研究方法也在文中進(jìn)行了闡述[27]。Marelli等將絲素蛋白用靜電紡絲法紡成直徑為6mm的管狀結(jié)構(gòu)，用作小口徑血管移植，并測定了其順應(yīng)性和爆破壓等力學(xué)性能[36]。Sato等報道了涂覆絲素蛋白多孔凝膠的靜電紡絲小口徑血管支架的性能研究方法，包括軸向/徑向拉伸強(qiáng)度、順應(yīng)性

49、和水滲透性等[47]。</p><p><b>　　課題研究方法</b></p><p>　　本課題主要分為兩個部分，第一部分是復(fù)合管狀支架制備方法的研究，第二部分是復(fù)合管狀支架性能的考察。</p><p>　　在第一部分中，課題使用的研究方法主要有以下幾種：</p><p>　　文獻(xiàn)研究法，通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)，了解材料的

50、制備方法；</p><p>　　分組實(shí)驗(yàn)法，根據(jù)控制變量原則設(shè)計多組實(shí)驗(yàn)，確定最優(yōu)方案；</p><p>　　定量分析法，利用冷凍干燥測定硫酸化絲素蛋白溶液的濃度；</p><p>　　定性分析法，利用掃描電鏡和傅里葉變換紅外光譜分析儀定性表征材料性能。</p><p>　　在第二部分中，課題使用的研究方法主要包括以下幾種：</p>

51、;<p>　　文獻(xiàn)研究法，查閱文獻(xiàn)，確定材料拉伸強(qiáng)度、縫合強(qiáng)度和順應(yīng)性的測試方法；</p><p>　　定量分析法，利用動態(tài)材料力學(xué)試驗(yàn)機(jī)測定材料相關(guān)力學(xué)性能；搭建水滲透性測試裝置測定復(fù)合管狀支架的水滲透性；</p><p>　　定性分析法，利用掃描電鏡表征復(fù)合管狀支架的表面形態(tài)；</p><p>　　動物實(shí)驗(yàn)法，進(jìn)行動物實(shí)驗(yàn)評估復(fù)合管狀支架在生物體內(nèi)

52、的生物學(xué)表現(xiàn)；</p><p>　　統(tǒng)計分析法，根據(jù)統(tǒng)計學(xué)原理分析多組實(shí)驗(yàn)之間的顯著性差異情況。</p><p><b>　　研究內(nèi)容</b></p><p>　　本實(shí)驗(yàn)的研究內(nèi)容主要分為兩個大部分，一是復(fù)合管狀支架制備方法的探究，二是復(fù)合管狀支架性能的考察和評估。</p><p>　　第一部分內(nèi)容主要包括蠶絲纖維的脫膠

53、處理、硫酸化絲素蛋白溶液的制備和復(fù)合管狀支架制備方法的探究。本實(shí)驗(yàn)利用硫酸化絲素蛋白多孔凝膠修飾編織的絲素蛋白管狀支架制備復(fù)合管狀支架。將編織的絲素蛋白管狀支架套在直徑為3mm的不銹鋼金屬棒上并一起插入模具中，再將硫酸化絲素蛋白溶液與PGDE充分混勻后緩慢注入到模具中，-20°C條件下冷凍24h后在編織的絲素蛋白管狀支架表面形成凝膠。實(shí)驗(yàn)中采用分組實(shí)驗(yàn)研究方法，設(shè)置不同濃度的硫酸化絲素蛋白溶液、不同編織密度的編織絲素蛋白管狀支

54、架和不同質(zhì)量配比的硫酸化絲素蛋白和PGDE混合溶液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，制備多種復(fù)合管狀支架。</p><p>　　第二部分內(nèi)容主要分為3個實(shí)驗(yàn)內(nèi)容。一是復(fù)合管狀支架表面形態(tài)表征，二是復(fù)合管狀支架水滲透性測試，三是復(fù)合管狀支架力學(xué)性能測試。使用掃描電鏡進(jìn)行復(fù)合管狀支架的表面形貌觀察；根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)我們自己搭建了一套水滲透性測試裝置，測定復(fù)合管狀支架的水滲透性；參考相關(guān)文獻(xiàn)中力學(xué)性能的測試方法，我們確定了復(fù)合管狀支架的力學(xué)性能測

55、試方案，并在動態(tài)材料力學(xué)試驗(yàn)機(jī)上進(jìn)行復(fù)合管狀支架力學(xué)性能的測試；根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)我們自己搭建順應(yīng)性測試裝置，測試復(fù)合管狀支架的順應(yīng)性。最終，根據(jù)測試結(jié)果確定出一套最優(yōu)的復(fù)合管狀支架制備方法，并用該方法制備出的復(fù)合管狀支架進(jìn)行動物實(shí)驗(yàn)。</p><p><b>　　材料與方法</b></p><p><b>　　蠶絲纖維的脫膠處理</b></p&

56、gt;<p>　　天然的蠶絲纖維主要由兩種蛋白組成，一是表面的絲膠蛋白，二是內(nèi)部的絲素蛋白。研究表明絲膠蛋白的生物相容性較差，利用蠶絲制備小口徑人工血管時必須首先去除蠶絲表面的絲膠蛋白，實(shí)驗(yàn)所用試劑和材料見附錄A。蠶絲纖維的脫膠處理具體步驟如下：</p><p>　　稱取1.696g無水碳酸鈉粉末，加入1000ml燒杯中；</p><p>　　量取800ml超純水加入上述燒杯

57、中，在燒杯中加入磁力轉(zhuǎn)子；</p><p>　　將燒杯置于恒溫磁力攪拌器上邊攪拌溶解邊加熱至沸騰；</p><p>　　在步驟（3）進(jìn)行過程中，稱取5g蠶絲纖維，剪成約1cm長，待用；</p><p>　　碳酸鈉溶液沸騰后加入剪短的蠶絲纖維，用鑷子分散蠶絲纖維，使其充分與溶液接觸，保持加熱沸騰30min后，取出蠶絲纖維；</p><p>　　

58、用超純水多次清洗脫膠的蠶絲，去除殘留在蠶絲纖維表面的絲膠蛋白。干燥備用。</p><p>　　編織的絲素蛋白管狀支架在制備復(fù)合管狀支架之前也必須進(jìn)行脫膠處理，其脫膠處理的方法和蠶絲纖維脫膠處理方法一樣。 </p><p>　　絲素蛋白水溶液的制備</p><p>　　采用CaCl2-CH3CH2OH-H2O體系（摩爾比1:2:8）溶解干燥后的脫膠蠶絲纖維，獲得絲素蛋

59、白鹽溶液。再利用蛇皮透析管透析絲素蛋白鹽溶液，進(jìn)而獲得絲素蛋白水溶液。溶液如圖2.1所示。其具體制備步驟如下：</p><p>　　按照CaCl2-CH3CH2OH-H2O摩爾比為1：2：8的比例稱取44.1g CaCl2H2O，量取35ml CH3CH2OH和32.4mlddH2O，放入250ml燒杯中，并加入磁力轉(zhuǎn)子；</p><p>　　將燒杯放在可控溫的加熱攪拌器上邊攪拌邊加熱，最

60、終維持溫度在78±2°C；</p><p>　　將9-10g脫膠蠶絲纖維按多次少量的方法加入到上述體系中，蠶絲纖維完全溶解后即得到絲素蛋白鹽溶液；</p><p>　　待絲素蛋白鹽溶液冷卻到室溫后用蛇皮透析管在超純水中透析9次以上，獲得絲素蛋白水溶液粗品；</p><p>　　將得到的絲素蛋白水溶液粗品在9000rpm條件下離心15min，去除雜

61、質(zhì)，即可獲得較為純凈的絲素蛋白水溶液，獲得的絲素蛋白水溶液保存在4°C冰箱內(nèi)。</p><p>　　(a) 絲素蛋白鹽溶液圖 (b) 絲素蛋白水溶液圖</p><p>　　圖2.1 絲素蛋白相關(guān)溶液圖</p><p>　　硫酸化絲素蛋白水溶液的制備</p><p>　　為了進(jìn)一步提

62、高絲素蛋白的抗凝血性能，本實(shí)驗(yàn)對絲素蛋白進(jìn)行硫酸化修飾。具體的實(shí)驗(yàn)步驟如下：</p><p>　　用冷凍干燥的方法獲得固體絲素蛋白，稱取0.5g絲素蛋白；</p><p>　　將20ml吡啶倒入燒杯中并逐漸加熱至80°C，另取30ml吡啶倒入燒杯中冰??；</p><p>　　將0.5g固體絲素蛋白放入上述加熱至80°C的20ml吡啶中，取5ml氯

63、磺酸逐滴加入，使其充分溶解；</p><p>　　將上述溶液倒入30ml冰浴吡啶中，并逐漸加熱至80°C，邊加熱邊攪拌；</p><p>　　取100ml超純水加入到上述溶液中，常溫下攪拌1h后去除未溶解部分；</p><p>　　將氫氧化鈉溶液逐滴加入，待pH接近7時真空過濾除去不溶物；</p><p>　　向溶液中加入250ml

64、乙醇，待溶液分層后吸出上層黃色液體，離心獲得白色沉淀；</p><p>　　將白色沉淀重新溶解在少量超純水中，蛇皮透析管透析去除雜質(zhì)離子即可獲得硫酸化絲素蛋白水溶液</p><p>　　絲素蛋白的硫酸化修飾結(jié)果用傅里葉變換紅外光譜儀進(jìn)行驗(yàn)證，使用KBr壓片法，每個樣品隨機(jī)選取32個點(diǎn)進(jìn)行掃描獲得紅外吸收光譜圖，分辨率為4cm-1，波數(shù)范圍為550-4000cm-1。</p>

65、<p>　　硫酸化絲素蛋白復(fù)合管狀支架的制備</p><p>　　在以前的研究中，研究者采用凝膠紡絲法、浸蘸法或靜電紡絲法等方法制備了絲素蛋白管狀支架。但是，這些管狀支架在干燥狀態(tài)下脆性較強(qiáng)，在濕潤狀態(tài)下力學(xué)強(qiáng)度又不夠，使得將來制備和臨床使用這些管狀支架變得非常困難。最近，Lovett等將力學(xué)性能提高后的凝膠紡絲絲素蛋白管狀支架成功移植到大鼠體內(nèi)，結(jié)果良好[5]。但是，這種管狀支架還需要進(jìn)一步修飾，優(yōu)化

66、其力學(xué)性能，血液相容性和血管細(xì)胞響應(yīng)等等。為了解決這些問題，本實(shí)驗(yàn)采用編織的絲素蛋白管狀支架和硫酸化絲素蛋白聯(lián)合制備復(fù)合管狀支架，并利用PGDE增加表面凝膠的柔順性，使得制備的復(fù)合管狀支架的順應(yīng)性滿足小口徑人工血管的要求，詳細(xì)的制備流程如圖2.2所示。復(fù)合管狀支架制備的實(shí)驗(yàn)研究共分為3組，如下：</p><p>　　使用不同編織密度的編織絲素蛋白管狀支架制備復(fù)合管狀支架；</p><p>

67、　　使用不同濃度的硫酸化絲素蛋白溶液制備復(fù)合管狀支架；</p><p>　　按不同質(zhì)量配比混合硫酸化絲素蛋白和PGDE溶液制備復(fù)合管狀支架。</p><p>　　具體的制備步驟如下：</p><p>　　在濃度為10%的硫酸化絲素蛋白溶液中按1:1的質(zhì)量配比加入PGDE，充分混勻后將混合溶液置于搖床上，160rpm搖晃1h，使兩者充分反應(yīng)；</p>&

68、lt;p>　　將脫膠后的編織絲素蛋白管狀支架套在直徑為3mm的不銹鋼金屬棒上，編織絲素蛋白管狀支架的長度為6-7mm，充分捋順編織的絲素蛋白管狀支架，使其與金屬棒較為緊密的貼上；</p><p>　　將套有編織絲素蛋白管狀支架的金屬棒插入內(nèi)徑為4.8mm的模具中，模具下端用一個內(nèi)徑為2.5mm的橡膠頭塞住，金屬棒插入模具后正好被2.5mm內(nèi)徑的橡膠頭卡住，保證其處在正中位置；</p><

69、p>　　將步驟（1）中的混合溶液緩慢注入到模具的空隙中，使溶液完全浸沒編織的絲素蛋白管狀支架，注意混合溶液一定要緩慢成股注入，盡量避免產(chǎn)生氣泡；</p><p>　　待溶液完全浸沒編織的絲素蛋白管狀支架后，靜置足夠長時間，保證編織的絲素蛋白管狀支架充分浸濕，同時注意模具中是否存在氣泡，如果存在氣泡，必須將氣泡排盡；</p><p>　　充分浸濕后將模具放入到-20°C冰箱中

70、，冷凍24h后取出。靜置3-5min后將金屬棒緩慢拔出模具，拔出后放入預(yù)先加熱的超純水中，注意拔除的時候盡量不要旋轉(zhuǎn)，防止外表面涂覆的凝膠層破損；</p><p>　　將制作好的復(fù)合管狀支架從金屬棒上緩慢取下，并放入到盛有超純水的燒杯中浸洗，去除凝膠中殘留的PGDE，每8h換一次水，共浸洗3天；</p><p>　　浸洗完成后用傅里葉變換紅外光譜儀檢測凝膠層中的PGDE是否完全被除去，浸洗

71、完全的復(fù)合管狀支架保存在PBS溶液中，備用。</p><p>　　復(fù)合管狀支架共分為3組進(jìn)行制備，每組復(fù)合管狀支架的制備流程跟上述流程一致，只是在制備過程中使用不同濃度的硫酸化絲素蛋白溶液，不同編織密度的編織絲素蛋白管狀支架和不同質(zhì)量配比的混合溶液而已。制備好的復(fù)合管狀支架均保存在PBS溶液中，放置在4°C冰箱內(nèi)。</p><p>　　(a) 編織的絲素蛋白管狀支架浸泡在混合溶液

72、中的示意圖</p><p>　　(b) 復(fù)合管狀支架制備后浸泡在超純水中的示意圖</p><p>　　圖2.2 硫酸化絲素蛋白復(fù)合管狀支架制備流程圖</p><p>　　復(fù)合管狀支架表面形態(tài)表征</p><p>　　將復(fù)合管狀支架切成圓環(huán)和矩形形狀，圓環(huán)的長度約為3mm，矩形塊的長度約為3mm，寬約為2mm。通過掃描電鏡（SEM）觀察復(fù)合管狀

73、支架的表面形態(tài)，包括內(nèi)表面、外表面和橫截面的形態(tài)特征。掃面電鏡電壓為20kv，使用導(dǎo)電膠將樣品固定在掃描電鏡樣品臺上，樣品在進(jìn)行掃描電鏡成像前進(jìn)行表面噴金處理，噴金厚度為20-30nm。</p><p><b>　　水滲透性測試</b></p><p>　　16號硅膠管一端連接在玻璃管位置較高的側(cè)口上，玻璃管如2.3(d)圖所示，另一端接上真空泵后放入儲水器中，玻璃管

74、另一個位置較低的側(cè)口接上同種型號的硅膠管，該硅膠管另一端放置在儲水器溶液表面。玻璃管下端開口也連接上同種型號的硅膠管，硅膠管豎直自然下垂，在離玻璃管較低側(cè)口豎直高度為1632mm處將硅膠管橫置，并用透明膠固定在圓盤上。硅膠管的另一端連接上模具，在兩者連接處用封口膜密封，保證不漏液。模具另一端連接長度約為25mm的復(fù)合管狀支架，復(fù)合管狀支架另一端通過模具以同樣的方式連接到硅膠管上，裝置如2.3(a)圖所示。實(shí)驗(yàn)開始后，開啟真空泵將儲水器中

75、的超純水抽到玻璃管中，玻璃管較低側(cè)口可以控制玻璃管中液面的高度，使其維持在離復(fù)合管狀支架垂直高度1632mm處，保證復(fù)合管狀支架受到的靜水壓力為120mmHg。硅膠管中空氣排盡且液面高度穩(wěn)定后，夾緊止血鉗，開始計時，將復(fù)合管狀支架管壁滲透出的水收集到燒杯中，用量筒測定其體積，復(fù)合管狀支架的尺寸通過數(shù)顯游標(biāo)卡尺測量。復(fù)合管狀支架的水滲透量計算公式如下：</p><p>　　水滲透量（P）=

76、 (2.1)</p><p>　　其中，V為復(fù)合管狀支架管壁滲透出的水體積，單位為ml；S為連入裝置中復(fù)合管狀支架的有效表面積，單位為cm2；T為測試的時間，單位為min。這樣計算出的水滲透率單位為ml/(cm2min1)。</p><p>　　圖2.3 復(fù)合管狀支架水滲透性測試裝置圖</p><p><b>　　力學(xué)性能測試</

77、b></p><p>　　目前，已有許多研究者報道了小口徑人工血管各種力學(xué)性能的測試方法。Marelli等報道了采用靜電紡絲法制備的直徑為6mm的絲素蛋白管狀支架的順應(yīng)性和爆破壓測試方法[36]。Sato等報道了涂覆絲素蛋白多孔凝膠的靜電紡絲小口徑血管支架的軸向拉伸強(qiáng)度、徑向拉伸強(qiáng)度和順應(yīng)性測試方法[47]。Liu等[48]報道了多層結(jié)構(gòu)絲素蛋白血管移植物的拉伸強(qiáng)度、縫合強(qiáng)度和順應(yīng)性等力學(xué)參數(shù)的測定方法。這

78、些研究內(nèi)容對本實(shí)驗(yàn)研究復(fù)合管狀支架的力學(xué)性能具有極為重要的指導(dǎo)意義。</p><p><b>　　軸向和徑向拉伸實(shí)驗(yàn)</b></p><p>　　復(fù)合管狀支架的軸向拉伸實(shí)驗(yàn)是在動態(tài)材料力學(xué)試驗(yàn)機(jī)上進(jìn)行的，使用250N的載荷傳感器測定拉伸載荷。軸向拉伸實(shí)驗(yàn)中樣品長度為40mm，實(shí)驗(yàn)前將樣品浸泡在仿生理溶液（PBS）中保持濕潤狀態(tài)。復(fù)合管狀支架在測試時保持濕潤狀態(tài)是必要的

79、，因?yàn)槭中g(shù)中使用的復(fù)合管狀支架為濕潤狀態(tài)且復(fù)合管狀支架植入體內(nèi)后在體內(nèi)也是以濕潤狀態(tài)存在的。實(shí)驗(yàn)中軸向拉伸應(yīng)變速率設(shè)定為5mm/min，直到復(fù)合管狀支架斷裂，軸向拉伸實(shí)驗(yàn)如圖2.4所示。管狀支架應(yīng)力-應(yīng)變曲線由動態(tài)材料力學(xué)試驗(yàn)機(jī)直接輸出，拉伸模量和拉伸強(qiáng)度由具體的應(yīng)力和應(yīng)變數(shù)據(jù)處理后得出。</p><p>　　(a) 軸向拉伸實(shí)驗(yàn)過程圖 (b) 復(fù)合

80、管狀支架斷裂圖</p><p>　　圖2.4 軸向拉伸實(shí)驗(yàn)圖</p><p>　　復(fù)合管狀支架的徑向拉伸實(shí)驗(yàn)也在同樣的動態(tài)材料力學(xué)試驗(yàn)機(jī)上進(jìn)行，力學(xué)傳感器量程為250N。徑向拉伸實(shí)驗(yàn)前我們需要加工定制一套特殊的夾具，夾具由兩部分組成，如圖2.5所示。圖2.5(a)是L型不銹鋼金屬棒立體圖，圖2.5(b)是L型不銹鋼金屬板立體圖。實(shí)驗(yàn)前同樣將復(fù)合管狀支架浸泡在PBS溶液中，實(shí)驗(yàn)時將復(fù)合管狀支

81、架剪成5mm長度的環(huán)形樣品，環(huán)形樣品套在兩個L型半圓形金屬棒上，拉伸兩個L型不銹鋼金屬板即可實(shí)現(xiàn)環(huán)形復(fù)合管狀支架的徑向拉伸，徑向拉伸速率設(shè)定為3mm/min。徑向拉伸實(shí)驗(yàn)過程如圖2.6所示。復(fù)合管狀支架徑向極限拉伸強(qiáng)度通過斷裂前最大拉伸載荷和有效截面積可以計算得出，有效截面積定義為2壁厚環(huán)形樣品軸向長度。因此，徑向極限強(qiáng)度的計算公式如下：</p><p>　　徑向極限拉伸強(qiáng)度（c-UTS）=

82、(2.2)</p><p>　　其中，F(xiàn)為斷裂前最大拉伸載荷，單位N；T為環(huán)形樣品的厚度，單位為m；L為環(huán)形樣品的軸向長度，單位為m；徑向極限強(qiáng)度的單位為MPa。</p><p>　　圖2.5 徑向拉伸實(shí)驗(yàn)夾具圖</p><p>　　圖2.6 徑向拉伸實(shí)驗(yàn)圖</p><p><b>　　縫合強(qiáng)度實(shí)驗(yàn)</b></p&

83、gt;<p>　　在動態(tài)材料力學(xué)試驗(yàn)機(jī)上進(jìn)行復(fù)合管狀支架的縫合強(qiáng)度實(shí)驗(yàn)，載荷傳感器量程為250N。復(fù)合管狀支架測試前浸泡在PBS溶液中，保持濕潤狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)時，取約20mm長度的復(fù)合管狀支架進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，復(fù)合管狀支架一端由加工定制的夾具夾緊，另一端在距離端口2mm處用5-0聚乙醇酸（PGA）帶針手術(shù)縫合線穿過復(fù)合管狀支架管壁，實(shí)驗(yàn)過程如圖2.7所示?？p合強(qiáng)度實(shí)驗(yàn)的拉伸速率設(shè)定為3mm/min，直到復(fù)合管狀支架管壁被拉破為止。在每

84、個樣品的橫截面圓周上每120o進(jìn)行一次縫合強(qiáng)度的實(shí)驗(yàn)，每個樣品重復(fù)進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)。</p><p>　　圖2.7 縫合強(qiáng)度實(shí)驗(yàn)圖</p><p><b>　　順應(yīng)性測試</b></p><p>　　將搭建的水滲透性測試裝置進(jìn)行適當(dāng)改進(jìn)后用于復(fù)合管狀支架的順應(yīng)性測試。將連接的復(fù)合管狀支架置于一個可密封的透明聚乙烯矩形盒子中，如圖2.8所示。復(fù)合管狀

85、支架兩端分別通過模具連接到兩根硅膠管上，一根硅膠管剩余的一端密封，另一根硅膠管剩余的一端連接到玻璃管上，玻璃管離復(fù)合管狀支架的水平高度可調(diào)節(jié)，測試順應(yīng)性時分別將高度設(shè)定為1632mm和1088mm，此高度產(chǎn)生的液體壓強(qiáng)分別為120mmHg和80mmHg。測試開始時，密封透明聚乙烯盒子中充滿水溶液，盒子正上方連接一根內(nèi)徑為0.9mm的毛細(xì)管，毛細(xì)管可度量出由復(fù)合管狀支架膨脹排擠的水的體積，水的體積用毛細(xì)管中的液面高度表示，裝置原理示意圖如

86、圖2.9所示。實(shí)驗(yàn)過程中需要分別測試出120mmHg和80mmHg壓強(qiáng)下復(fù)合管狀支架膨脹的體積，復(fù)合管狀支架的順應(yīng)性的計算公式如下：</p><p>　　順應(yīng)性（Cd%）= = (2.3)</p><p>　　公式中H2和H1分別代表在P2和P1壓強(qiáng)下毛細(xì)管中液體的高度，P2和P1分別代表120mmHg和80mmHg大小的壓強(qiáng)。</p><p>　　

87、圖2.8聚乙烯透明塑料盒實(shí)物圖</p><p>　　圖2.9 順應(yīng)性測試裝置原理示意圖[49]</p><p><b>　　爆破壓測試</b></p><p>　　復(fù)合管狀支架的爆破壓測試裝置如圖2.10所示。因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)中制備的復(fù)合管狀支架表面覆蓋的凝膠為多孔結(jié)構(gòu)，水滲透性數(shù)據(jù)也證實(shí)了這個情況，所以在實(shí)驗(yàn)前需要在復(fù)合管狀支架內(nèi)壁貼附一層不透氣的

88、薄膜，防止其漏氣。實(shí)驗(yàn)時，勻速打氣直到復(fù)合管狀支架破裂為止，復(fù)合管狀支架的爆破壓由裝置中的壓力表讀出。</p><p>　　圖2.10 爆破壓簡易測試裝置圖</p><p><b>　　動物實(shí)驗(yàn)</b></p><p>　　復(fù)合管狀支架的動物實(shí)驗(yàn)由校外合作單位（昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院）進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)動物為比格犬，置換的血管為犬右腿股動脈，動物實(shí)驗(yàn)

89、如圖2.11所示。</p><p>　　(a) 比格犬 (b) 血管置換手術(shù)</p><p>　　圖2.11 動物實(shí)驗(yàn)圖片</p><p><b>　　統(tǒng)計學(xué)分析</b></p><p>　　使用Matlab軟件中的單因素方差分析和t-檢驗(yàn)工具包（顯著性水平設(shè)

90、置為0.05），對水滲透性和力學(xué)實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，確定出復(fù)合管狀支架制備的最優(yōu)方案。除特殊情況外實(shí)驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)一表示成平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式。</p><p><b>　　結(jié)果與討論</b></p><p><b>　　蠶絲纖維的脫膠處理</b></p><p>　　本實(shí)驗(yàn)中采用的蠶絲纖維脫膠處理方法為：0.0

91、2M濃度的碳酸鈉溶液煮沸脫膠30min，每次脫膠蠶絲纖維質(zhì)量為5g。脫膠實(shí)驗(yàn)完成后，我們采用掃描電鏡（SEM）對脫膠后的蠶絲纖維進(jìn)行微觀結(jié)構(gòu)的觀察，結(jié)果如圖3.1所示。從蠶絲脫膠掃描電鏡圖來看，脫膠后蠶絲纖維表面的絲膠蛋白完全脫凈，脫膠效果良好。</p><p>　　(a) 低倍率SEM圖(b) 中倍率SEM圖</p><p>　　(c) 高倍率SEM圖</p><p

92、>　　圖3.1 脫膠蠶絲掃描電鏡圖</p><p>　　硫酸化絲素蛋白溶液和復(fù)合管狀支架的制備</p><p>　　硫酸化絲素蛋白溶液的制備</p><p>　　在制備硫酸化絲素蛋白溶液之前必須先獲得絲素蛋白固體。如前文所述方法，使用CaCl2-CH3CH2OH-H2O體系溶解脫膠后的蠶絲纖維，得到絲素蛋白鹽溶液，再通過透析和離心兩步操作即可獲得較為純凈的絲素

93、蛋白水溶液。使用冷凍干燥機(jī)獲得固體絲素蛋白，如圖3.2所示。按上文敘述的方法制備出硫酸化絲素蛋白，傅里葉變換紅外光譜儀驗(yàn)證絲素蛋白硫酸化情況，結(jié)果如圖3.3所示。</p><p>　　圖3.2 冷凍干燥后獲得的絲素蛋白固體圖</p><p>　　圖3.3 SF（藍(lán)色）和S-SF（紅色）的紅外光譜圖</p><p>　　圖3.3顯示了在600-1600cm-1波數(shù)范圍

94、內(nèi)兩種物質(zhì)的紅外吸收峰圖像。圖中A曲線是絲素蛋白的紅外光譜圖像，B曲線是硫酸化絲素蛋白的紅外光譜圖像。從圖像中可以清楚看見，硫酸化絲素蛋白在1008.67cm-1和1046.45cm-1波數(shù)處出現(xiàn)了強(qiáng)烈的特征吸收峰，這兩個強(qiáng)烈的特征吸收峰是由有機(jī)硫酸鹽相關(guān)官能團(tuán)振動產(chǎn)生的。另外，硫酸化作用，如烷基硫酸鹽中的SO2、磺胺藥物中的SO2以及有機(jī)硫酸鹽中SO2與蠶絲的酰胺III帶相互作用，也會使得在1180-1300cm-1波數(shù)范圍內(nèi)的特征吸

95、收峰加強(qiáng)變寬。結(jié)果表明絲素蛋白與氯磺酸反應(yīng)后使得絲素蛋白分子上帶有了硫酸基團(tuán)，硫酸化實(shí)驗(yàn)成功。</p><p><b>　　復(fù)合管狀支架的制備</b></p><p>　　按照上文敘述的方法制備復(fù)合管狀支架，-20°C條件下冷凍24h后從模具中拔出的復(fù)合管狀支架如圖3.4所示。</p><p>　　圖3.4 冷凍制備的復(fù)合管狀支架圖&

96、lt;/p><p>　　從圖3.4 (a)可以看出，3%濃度S-SF制備的復(fù)合管狀支架其表面覆蓋的凝膠不均勻，而且覆蓋的凝膠層厚度極薄。從圖3.4(b)和(c)可以看出，6%和9%濃度S-SF制備的復(fù)合管狀支架表面覆蓋的凝膠較均勻，厚度相對較厚，而且覆蓋的凝膠與編織的絲素蛋白管狀支架結(jié)合緊密。同樣地，質(zhì)量配比為2:1的低濃度S-SF和PGDE混合溶液冷凍制備的復(fù)合管狀支架表面的凝膠層情況與上述對應(yīng)圖片展示的情況基本一

97、致，但是PGDE與9%濃度S-SF按質(zhì)量配比2:1制備的復(fù)合管狀支架其表面凝膠柔韌性極差，極容易從編織的絲素蛋白管狀支架表面脫落，如圖3.4(d)所示。我們認(rèn)為3%的濃度太低，冷凍形成的凝膠的交聯(lián)程度很低，凝膠的強(qiáng)度也不夠。高濃度S-SF溶液在高濃度PGDE的作用下，S-SF分子結(jié)構(gòu)遭到破壞，分子鏈斷裂，從而使得形成的凝膠的交聯(lián)程度降低，凝膠脆性大，且與編織的絲素蛋白管狀支架結(jié)合不緊密，易脫落。</p><p>

98、<b>　　復(fù)合管狀支架表征</b></p><p>　　支架表征主要包括兩個內(nèi)容：一是用傅里葉變換紅外光譜儀驗(yàn)證多孔凝膠中的PGDE已經(jīng)完全清洗干凈；二是使用掃描電鏡對復(fù)合管狀支架的表面形貌進(jìn)行觀察。</p><p>　　如前文所述，將制備的復(fù)合管狀支架置于超純水中浸洗，每8h換一次超純水，總共浸洗3天。浸洗結(jié)束后，將復(fù)合管狀支架自然晾干，取表面的多孔凝膠進(jìn)行紅外光

99、譜分析，未浸泡超純水的多孔凝膠為對照組，結(jié)果如圖3.5所示。</p><p>　　圖3.5 浸洗前（紅色）和浸洗后（黑色）凝膠的紅外光譜圖</p><p>　　圖中紅色曲線是浸洗前凝膠的紅外光譜圖像，黑色曲線是超純水浸洗3天后凝膠的紅外光譜圖像。結(jié)果顯示，超純水浸洗3天后凝膠在858.3cm-1 和931.6 cm- 1處的吸收峰明顯消失，這兩個吸收峰都是PGDE兩端環(huán)醚振動產(chǎn)生的特征吸收

100、峰，同時，浸洗3天后凝膠在1104.7 cm- 1處的特征吸收峰也基本完全消失，該處的特征吸收峰是由烷基醚—CH2—O—CH2—不對稱伸縮產(chǎn)生?？傊?，結(jié)果表明超純水浸洗3天后硫酸化絲素蛋白凝膠中的PGDE已經(jīng)完全清洗干凈，保證了復(fù)合管狀支架仍然具有良好的生物相容性，植入體內(nèi)后不會引起炎癥反應(yīng)。</p><p>　　用掃描電鏡表征復(fù)合管狀支架的表面形態(tài)，結(jié)果如圖3.6所示。圖(a)和圖(b)分別是復(fù)合管狀支架的外表

101、面和橫截面掃描電鏡圖（SEM）。從圖(a)可以看出硫酸化絲素蛋白凝膠表面光滑，從圖(b)可以看出硫酸化絲素蛋白凝膠與編織的絲素蛋白管狀支架結(jié)合緊密，且為多孔結(jié)構(gòu)。</p><p>　　圖3.6 復(fù)合管狀支架SEM圖</p><p><b>　　水滲透性</b></p><p>　　如前文所述，復(fù)合管狀支架的水滲透性由我們自己搭建的水滲透性測試裝

102、置測定，水滲透性測試裝置圖在前文已經(jīng)展示。液面高度由玻璃管位置較低的側(cè)口控制，在整個裝置運(yùn)行達(dá)到穩(wěn)定后進(jìn)行復(fù)合管狀支架的水滲透性測試，每個樣品的水滲透性測試實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行3次。根據(jù)復(fù)合管狀支架的水滲透性情況，分別設(shè)置不同的測試時間進(jìn)行測量，管壁滲透的水的體積由量筒測量，復(fù)合管狀支架的尺寸由數(shù)顯游標(biāo)卡尺讀出。通過公式(2.1)就能計算出每個復(fù)合管狀支架的水滲透量，具體的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如表3.1所示。</p><p>　　表

103、3.1 硫酸化絲素蛋白復(fù)合管狀支架水滲透性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)</p><p>　　表3.1.1 不同編織密度的編織絲素蛋白管狀支架的水滲透量</p><p>　　表3.1.2 覆蓋硫酸化絲素蛋白凝膠的復(fù)合管狀支架的水滲透量</p><p>　　表3.1.3 不同濃度硫酸化絲素蛋白溶液制備的復(fù)合管狀支架的水滲透量</p><p>　　表3.1.4 PGD

104、E：S-SF在不同配比條件下復(fù)合管狀支架的水滲透量</p><p>　　表3.1.1結(jié)果顯示編織密度越密，編織絲素蛋白管狀支架的水滲透量越小，但是編織絲素蛋白管狀支架的水滲透量并不與編織的密度成正比關(guān)系，水滲透量隨編織密度的增大而減小，且減小的速率隨編織密度的增加也逐漸減小，這正好復(fù)合我們預(yù)期的情況。</p><p>　　從表3.1.2結(jié)果來看，涂覆凝膠后復(fù)合管狀支架的水滲透量遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于未涂

105、覆凝膠的編織絲素蛋白管狀支架的水滲透量，且編織密度越大復(fù)合管狀支架的水滲透量越小。從表3.1.3的結(jié)果來看，硫酸化絲素蛋白溶液的濃度越高制備出的復(fù)合管狀支架的水滲透量越小，這可以解釋為S-SF的濃度越高，形成的凝膠的交聯(lián)程度越高，復(fù)合管狀支架的抗?jié)B透性越好。從表3.1.4結(jié)果來看，低濃度硫酸化絲素蛋白溶液條件下，PGDE與S-SF之間的質(zhì)量配比越高，復(fù)合管狀支架的水滲透量越小，但是當(dāng)S-SF濃度增為9%后PGDE與S-SF的高質(zhì)量配比卻

106、使復(fù)合管狀支架的水滲透量增加，這個現(xiàn)象我們解釋為當(dāng)S-SF濃度和PGDE量均較高時，單位質(zhì)量的S-SF將與更多量的PGDE發(fā)生反應(yīng)，使得S-SF的分子鏈遭到破壞，從而導(dǎo)致冷凍形成的凝膠的交聯(lián)程度降低，凝膠強(qiáng)度大大降低，容易在表面產(chǎn)生裂痕，如圖3.7所示。</p><p>　　圖3.7 復(fù)合管狀支架表面凝膠裂痕圖</p><p>　　使用Graphpad軟件繪制出復(fù)合管狀支架的水滲透性結(jié)果柱