基于兔耳窗實(shí)驗(yàn)研究拉伸載荷對(duì)血管新生的影響

1、<p>　　單位代碼 10006 </p><p>　　學(xué) 號(hào) 10101044 </p><p>　　分類號(hào) Q6 </p><p><b>　　畢業(yè)設(shè)計(jì)(論文)</b></p><p>　　基于兔耳窗實(shí)驗(yàn)

2、研究拉伸載荷對(duì)血管新生的影響</p><p><b>　　2014年6月</b></p><p>　學(xué)院名稱生物與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院</p><p>　專業(yè)名稱生物醫(yī)學(xué)工程</p><p>　學(xué)生姓名晏 洋</p><p>　指導(dǎo)教師趙 峰</p><p><b>

3、　　北京航空航天大學(xué)</b></p><p>　　本科畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文）任務(wù)書(shū)</p><p>　?、?、畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文）題目：</p><p>　　基于兔耳窗實(shí)驗(yàn)研究拉伸載荷對(duì)血管新生的影響 </p><p>　　Ⅱ、畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文）使

4、用的原始資料（數(shù)據(jù)）及設(shè)計(jì)技術(shù)要求：</p><p>　　血管新生對(duì)力學(xué)環(huán)境的響應(yīng)研究對(duì)創(chuàng)傷組織的血管重建和工程化培養(yǎng)組織的血管生成都具有重要的研究意義。本課題擬在經(jīng)典的微血管觀察實(shí)驗(yàn)——兔耳窗實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)特殊的兔耳窗，對(duì)兔耳窗部位施加拉伸載荷，觀測(cè)血管的新生并探索力學(xué)環(huán)境對(duì)血管新生的影響。目前已對(duì)相關(guān)研究有較全面的調(diào)研，對(duì)兔耳窗實(shí)驗(yàn)技術(shù)進(jìn)行了一些預(yù)實(shí)驗(yàn)，已經(jīng)對(duì)兔耳窗及其加載裝置有初步的設(shè)計(jì)方案，研究條件具

5、備。 </p><p>　?、?、畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文）工作內(nèi)容：</p><p>　　1. 文獻(xiàn)調(diào)研，完成開(kāi)題報(bào)告； 　　　　　</p><p>　　2. 兔耳窗的設(shè)計(jì)與加工；

6、 </p><p>　　3. 兔耳窗中新生血管觀測(cè)實(shí)驗(yàn)； 　　　　</p><p>　　4. 可施加拉伸載荷的兔耳窗的研制； 　　　　　</p><p>　　5. 拉伸載荷和無(wú)載荷條件下兔耳窗中血管新生的對(duì)照

7、實(shí)驗(yàn)； </p><p>　　6. 新生血管的對(duì)比分析; 　　　　　 　　　　　</p><p>　　7. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果整理，論文撰寫。 　　　　</p><p><b>　?、?、主要參考資料：</b>&

8、lt;/p><p>　　[1] Fukumura Dai, Window Models.in Microvascular Research, Ed. by David Shepro, Elsevier, 2006. Chapter 24, 151-157;

9、 </p><p>　　[2] Tomizawa Y, Suzuki Y, etal, Macroscopic Sequential Pictures of Angiogenesis in a Rabbit Ear Chamber. Journal of Investigative Surgery,2002; 15: 269-274；

10、 </p><p>　　[3] Komori K, Tomizawa Y, etal, A Single Local Application of Recombinant Human Basic Fibroblast Growth Factor Accelera

11、tes Initial Angiogenesis During Wound Healing in Rabbit Ear Chamber. Anesth Analg, 2005; 100: 830-834; </p>&l

12、t;p>　　[4] Ichioka S,Shibata M,Effects of Shear Stress on Wound-Healing Angiogenesis in the Rabbit Ear Chamber. J Surgical Research, 1997; 72: 29–35;

13、 </p><p>　　[5] Matlaga BF, Salthouse TN, The rabbit ear chamber: a unique in vivo model for the continuous observation of implanted biomaterialsBi

14、omat Med Dev Art Org, 1976; 4: 359-366. </p><p>　　院（系） 生物與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院 專業(yè)類 生物醫(yī)學(xué)工程 班</p>

15、<p><b>　　學(xué)生</b></p><p>　　畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文）時(shí)間： 自 年 月 日至 年 月 日</p><p>　　答辯時(shí)間： 年 月 日 成績(jī)</p><p><b>　　指導(dǎo)教師：</b></p><

16、;p>　　兼職教師或答疑教師（并指出所負(fù)責(zé)部分）：</p><p><b>　　教研室主任</b></p><p>　　注：任務(wù)書(shū)應(yīng)該附在已完成的畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文）的首頁(yè)。</p><p><b>　　本人聲明</b></p><p>　　我聲明，本論文及其研究工作是由本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下獨(dú)立完成的

17、，在完成論文時(shí)所利用的一切資料均已在參考文獻(xiàn)中列出。</p><p><b>　　作者：晏 洋</b></p><p><b>　　簽字：</b></p><p>　　時(shí)間：2014年 6月</p><p>　　基于兔耳窗實(shí)驗(yàn)研究拉伸載荷對(duì)血管新生的影響</p><p>　

18、　學(xué) 生：晏 洋 </p><p><b>　　指導(dǎo)教師：趙 峰</b></p><p><b>　　摘 要</b></p><p>　　大量的文獻(xiàn)報(bào)道并證實(shí)了力學(xué)載荷對(duì)新生血管形成的重要影響。這些研究中大部份集中在血管內(nèi)血流產(chǎn)生的剪切應(yīng)力對(duì)新生血管形成的影響，而血管周圍力學(xué)載荷對(duì)新生血管形成的研究相

19、對(duì)較少。在傳統(tǒng)的兔耳窗新生血管形成過(guò)程中，幾乎可近似地認(rèn)為血管僅受到血管內(nèi)的血流動(dòng)力學(xué)作用，受到外部組織的整體力學(xué)載荷為零。為了研究力學(xué)載荷對(duì)新生血管的影響，本課題基于兔耳窗技術(shù)，設(shè)計(jì)加工出一種新型兔耳窗裝置植入兔耳，獲取施加拉伸載荷力學(xué)環(huán)境下血管新生的圖像，初步分析拉伸載荷對(duì)新生血管的影響。</p><p>　　本文根據(jù)蓋片材料的不同將兔耳窗分為三組，分別是云母蓋片、硅膠蓋片、拉伸硅膠蓋片。不同兔耳窗按照相同的

20、手術(shù)操作植入兔耳內(nèi)。在手術(shù)后的第3、7、10、13、15天分別進(jìn)行活體顯微鏡觀察，拍攝血管圖像進(jìn)行圖像處理分析。</p><p>　　通過(guò)實(shí)驗(yàn)，我們?cè)诒緦?shí)驗(yàn)室建立了一套基于兔耳窗技術(shù)研究新生血管的實(shí)驗(yàn)方法。我們也初步嘗試了施加拉伸載荷研究新生血管的實(shí)驗(yàn)。同時(shí)我們還探索了新生血管的定量分析方法，用血管相對(duì)面積來(lái)定量分析新生血管。</p><p>　　最后我們得到了一些結(jié)果：1）云母蓋片組的血

21、管新生要早于硅膠蓋片組和拉伸硅膠蓋片組，但在第7天三組均有新生血管出現(xiàn)；2）在兔耳窗組織愈合過(guò)程中，新生血管形成是一個(gè)初期增多，晚期減少的過(guò)程，在第7、10、13、15天，血管相對(duì)面積無(wú)顯著性差異。</p><p>　　關(guān)鍵詞：兔耳窗、拉伸載荷、血管新生</p><p>　　The study of tensile loads effects on angiogenesis based o

22、n rabbit ears chamber experiment</p><p>　　Author : Yuan Zhen</p><p>　　Tutor : Zhao Feng</p><p><b>　　Abstract</b></p><p>　　A large number of reports and conf

23、irmed a significant influence on the mechanical load on neovascularization. Most of these studies focus on the effects of shear stress in blood flow resulting in the formation of new blood vessels, and blood vessels arou

24、nd the relatively few studies on the mechanical load neovascularization. In traditional window rabbit ears during angiogenesis, can be approximately considered almost only by the hemodynamic effects of vascular vessels w

25、ithin the tissue affected </p><p>　　To study the effect of mechanical load on angiogenesis, mechanical environment under tensile loads image angiogenesis rabbit ears on the topic window technique is applied

26、to design a new type of processing device implantation window rabbit ears rabbit ears, acquisition, preliminary analysis of the tensile load effect on angiogenesis. Different rabbit ears in the same window operative impl

27、antation rabbit ears. In the first day after the operation were 3、7、10、13、15 vivo microscopy, the blood vesse</p><p>　　Through experiments, we have established the laboratory experimental method based on a s

28、et of rabbit ears Window technology research neovascularization. We also tried the experiment initial tensile load is applied research neovascularization. We also explored the quantitative analysis of new blood vessels,

29、with a quantitative analysis of the blood vessels to the relative size neovascularization.</p><p>　　Finally we got some results: 1) the mica group angiogenesis cover sheet to the cover sheet prior to silicon

30、e silicone group and stretched cover sheet groups, but the three groups at 7 days there were neovascularization; 2) a window in the rabbit ear tissue healing process, an initial neovascularization is increased, reducing

31、the process advanced, at 7,10,13,15 days, the relative area of blood vessels was no significant difference.</p><p>　　Key words：The rabbit ear chamber, tensile loads, angiogenesis</p><p><b>

32、;　　目 錄</b></p><p><b>　　1緒論1</b></p><p>　　1.1新生血管及其形成1</p><p>　　1.2影響血管新生的因素2</p><p>　　1.2.1血管內(nèi)皮祖細(xì)胞(Endothelial progenitor cells，EPC)2</p&

33、gt;<p>　　1.2.2成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Fibroblast growth factor，F(xiàn)GF)3</p><p>　　1.2.3血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)3</p><p>　　1.2.4血小板衍生性生長(zhǎng)因子(Platelet derived growth factor，PDGF)3&l

34、t;/p><p>　　1.2.5一氧化氮(Nitrogen monoxidum，NO)3</p><p>　　1.2.6血管生成素(Angiopoietin，Ang)3</p><p>　　1.2.7力學(xué)載荷(Mechanical load，ML)4</p><p>　　1.3力學(xué)環(huán)境對(duì)新生血管的影響4</p><p&

35、gt;　　1.4新生血管形成的研究方法6</p><p>　　1.4本文的立題思路和研究意義8</p><p>　　1.4.1立題思路8</p><p>　　1.4.2研究意義9</p><p>　　1.4.3研究思路9</p><p>　　2兔耳窗的設(shè)計(jì)及植入實(shí)驗(yàn)11</p><p&g

36、t;　　2.1兔耳窗的設(shè)計(jì)11</p><p>　　2.2兔耳窗的植入實(shí)驗(yàn)12</p><p>　　2.2.1實(shí)驗(yàn)分組12</p><p>　　2.2.2兔耳窗的植入13</p><p>　　2.3實(shí)驗(yàn)后兔子的飼養(yǎng)16</p><p><b>　　2.4小結(jié)16</b></p&g

37、t;<p><b>　　2.5討論16</b></p><p>　　3新生血管圖像的采集和分析18</p><p>　　3.1耳窗的愈合18</p><p>　　3.2活體顯微鏡觀察18</p><p>　　3.2新生血管圖像的采集20</p><p>　　3.3新生血管圖

38、像的分析22</p><p><b>　　3.3小結(jié)23</b></p><p><b>　　3.4討論24</b></p><p>　　3.4.1 兔耳窗的改進(jìn)24</p><p>　　3.4.1 手術(shù)方案的完善24</p><p>　　3.4.1 圖像采集技術(shù)

39、24</p><p>　　3.4.1 圖像處理方法的改進(jìn)25</p><p>　　3.5 進(jìn)一步工作展望25</p><p><b>　　4結(jié)論26</b></p><p><b>　　致謝27</b></p><p><b>　　參考文獻(xiàn)28</b

40、></p><p><b>　　附錄33</b></p><p><b>　　1緒論</b></p><p>　　新生血管形成在很多疾病中起關(guān)鍵性作用，例如血管的過(guò)度生成引起的癌癥、動(dòng)脈粥樣硬化、慢性炎癥和糖尿病性視網(wǎng)膜病變等[1,2]，以及血管的形成不足引起的心肌梗死后的結(jié)疤和慢性傷口愈合失敗[3]。而新興的組織

41、工程面臨的一個(gè)重大難題就是如何在體外形成三維血管網(wǎng)為工程化組織（器官）提供血供，此即組織工程的再血管化難題[4]等。因此，新生血管形成一直是多個(gè)生物和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)和難題之一，研究人員力圖闡明新生血管形成過(guò)程、機(jī)制和尋求促進(jìn)/抑制新生血管形成的策略。</p><p>　　窗口模式一般允許長(zhǎng)期持續(xù)或反復(fù)觀察，因而非常適合對(duì)生理和病理活動(dòng)時(shí)間過(guò)程的研究[5]。窗口模式最適用于活體顯微鏡檢查以及適合研究血管生成、微

42、循環(huán)、腫瘤和工程化組織生長(zhǎng)，疾病過(guò)程和治療反應(yīng)。兔耳密布著豐富的毛細(xì)血管網(wǎng)，是研究血管新生的良好平臺(tái)。在兔耳上的窗口模式即兔耳窗能為新生血管的研究提供方便。</p><p>　　生理機(jī)制調(diào)節(jié)血管生成還沒(méi)有在活體上得到充分的研究。為此，本課題擬在經(jīng)典的微血管觀察實(shí)驗(yàn)——兔耳窗實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)特殊的兔耳窗，對(duì)兔耳窗部位施加拉伸載荷，活體顯微鏡檢查觀測(cè)血管的新生并探索力學(xué)環(huán)境對(duì)血管新生的影響，從而建立一套研究方法，初

43、步分析力學(xué)環(huán)境對(duì)新生血管形成的影響。</p><p>　　1.1新生血管及其形成</p><p>　　血管生長(zhǎng)包括兩個(gè)概念。第一是胚胎期的血管發(fā)生(vasculogenesis，VG)，第二是出生后的血管新生(angiogenesis，AG)。VG指的是在沒(méi)有血管系統(tǒng)的情況下，由血管內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor，cells，EPCs)或成血管細(xì)胞(angiobl

44、asts)分化成內(nèi)皮細(xì)胞，同時(shí)形成血管網(wǎng)。一般來(lái)說(shuō)，它是以造血干細(xì)胞(HSC)為中心、EPCs在周圍的血島開(kāi)始[6]。AG是一個(gè)極為復(fù)雜的病理生理過(guò)程，主要是內(nèi)皮細(xì)胞從已有的血管處以出芽和套疊的方式直接生長(zhǎng)而成[7,8]。在內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF) 等生化因子的調(diào)控[8]和力學(xué)載荷的刺激下，已有的毛細(xì)血管內(nèi)皮腫脹、分裂、增生，形成實(shí)質(zhì)性的內(nèi)皮細(xì)胞條索(芽)，向外延

45、伸，在毛細(xì)血管內(nèi)血流的沖擊下，條索逐漸出現(xiàn)管腔，形成再生的毛細(xì)血管，而后經(jīng)一系列過(guò)程形成相應(yīng)的血管平滑肌及外膜[8]。</p><p>　?。ˋ）血管發(fā)生；（B）血管新生；（C）血管發(fā)生和血管新生</p><p>　　圖1.1 血管生長(zhǎng)[9]</p><p>　　1.2影響血管新生的因素</p><p>　　1.2.1血管內(nèi)皮祖細(xì)胞(Endo

46、thelial progenitor cells，EPC)</p><p>　　血管內(nèi)皮祖細(xì)胞在出生后的機(jī)體內(nèi)定居于骨髓和血液循環(huán)中。它是一群具有游走特征的、能進(jìn)一步增殖分化的幼稚內(nèi)皮細(xì)胞，是血管內(nèi)皮的前體細(xì)胞，亦稱血管母細(xì)胞，雖缺乏成熟內(nèi)皮細(xì)胞的特征性表型而不能形成管腔樣結(jié)構(gòu)，但其參與胚胎期的血管發(fā)育，在成年的血管新生中也起著重要的作用[10,11]。</p><p>　　1.2.2成纖

47、維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Fibroblast growth factor，F(xiàn)GF)</p><p>　　FGF能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、形成管腔，有較強(qiáng)的血管生成作用。大劑量的FGF促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的形成，血管內(nèi)膜過(guò)度增厚；小劑量的FGF僅對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生有益影響。另外FGF能夠使VEGF表達(dá)上調(diào)[12]。</p><p>　　1.2.3血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascular endothelia

48、l growth factor，VEGF)</p><p>　　VEGF是由兩個(gè)相同多肽鏈以二硫鍵組成的二聚體糖蛋白，通過(guò)三種酪氨酸激酶受體：受體l(Fltl)、受體2(KDR/Flkl)和受體3(Flk4)高效、特異地作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，促使血管內(nèi)膜再生及血管通透性增加[13]。VEGF可以促進(jìn)缺血區(qū)側(cè)枝的建立，增加缺血組織的血供，改善其功能[11]。</p><p>　　1.2.4血小

49、板衍生性生長(zhǎng)因子(Platelet derived growth factor，PDGF)</p><p>　　PDGF是間充質(zhì)來(lái)源細(xì)胞如成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等的有絲分裂原，具有促血管再生作用。除血小板d顆粒外，許多雙倍體細(xì)胞如內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞等均可分泌PDGF。PDGF能拮抗低氧所致的培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增生能力的下降，劑量越大，效果越明顯[14]。</p><p>　　1.2

50、.5一氧化氮(Nitrogen monoxidum，NO)</p><p>　　NO是一種無(wú)機(jī)小分子，普遍存在于脊柱動(dòng)物的各種細(xì)胞中，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞問(wèn)的信息傳遞、介導(dǎo)細(xì)胞免疫，對(duì)血管、神經(jīng)系統(tǒng)和免疫功能等起重要的調(diào)節(jié)作用[9]。一般來(lái)說(shuō)，NO可通過(guò)觸發(fā)血管活性物質(zhì)調(diào)節(jié)血管生長(zhǎng)，調(diào)節(jié)血管的口徑和流量，對(duì)肉芽組織的新生血管提供充足的血供，有利于新生血管的生長(zhǎng)[15]。</p><p>　　1.2

51、.6血管生成素(Angiopoietin，Ang)</p><p>　　Ang有四種同分異構(gòu)體，分別是Ang1、Ang2、Ang3和Ang4。臨床應(yīng)用最廣泛的是Ang1。Ang的受體是帶有免疫球蛋白和表皮生長(zhǎng)因子同源結(jié)構(gòu)域的酪氨酸激酶(Tie)。酪氨酸激酶又包括受體1(Tie1)和受體2(Tie2)。所有Ang的同分異構(gòu)體，均為Tie2的配體。Ang1誘導(dǎo)Tie2磷酸化，使內(nèi)皮細(xì)胞出芽形成正常的血管樹(shù)枝狀結(jié)構(gòu)，維

52、持血管結(jié)構(gòu)的完整性和穩(wěn)定性，吸引血管周圍細(xì)胞包圍、支持內(nèi)皮細(xì)胞重塑、成熟，促進(jìn)局部側(cè)支循環(huán)的建立。Ang2則抑制Ang1的作用[16]。</p><p>　　1.2.7力學(xué)載荷(Mechanical load，ML)</p><p>　　有研究表明，力學(xué)載荷在新生血管形成過(guò)程中起做重要的調(diào)控作用[17-19]。新生血管形成不僅受到全身代謝因子和血管所處微環(huán)境的調(diào)控[7,20]，力學(xué)載荷也是

53、其中的重要調(diào)控因素。血管受到顯著的力學(xué)作用，力學(xué)載荷來(lái)源于內(nèi)皮細(xì)胞本身、胞外基質(zhì)的反作用、血流和周圍組織的作用[21,22]。血流產(chǎn)生的流體動(dòng)力學(xué)載荷來(lái)自于血管內(nèi)血液的流動(dòng)和脈動(dòng)的血壓，可表征為血管壁的切應(yīng)力和周向應(yīng)力[23,24]，血管縱向血壓以及血管與周圍組織的作用可用沿血管的縱向張應(yīng)力表征[25,26]。血管應(yīng)力的持續(xù)動(dòng)態(tài)變化，將不斷地改變血管的結(jié)構(gòu)和形態(tài)，這就是血管重建[27]；而當(dāng)血管在胚胎發(fā)育、血管損傷等生理和病理情況下，血

54、管在力學(xué)載荷及其它因子的調(diào)控下，會(huì)出芽或套疊形成新的血管，此即新生血管形成[7,28]。另外新生血管形成過(guò)程中內(nèi)皮細(xì)胞的遷移、腔管的形成、平滑肌細(xì)胞的遷移等都明顯受力轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的控制[29]。</p><p>　　1.3力學(xué)環(huán)境對(duì)新生血管的影響</p><p>　　目前，已有大量的文獻(xiàn)報(bào)道并證實(shí)了力學(xué)載荷對(duì)新生血管形成的重要影響。這些研究中大部份集中在血管內(nèi)血流產(chǎn)生的剪切應(yīng)力對(duì)新生血管形成的

55、影響[30]，而血管周圍力學(xué)載荷對(duì)新生血管形成的研究相對(duì)較少。這些研究主要集中在對(duì)骨折愈合過(guò)程、骨骼肌的過(guò)載訓(xùn)練、組織工程支架材料的再血管化等方面的研究。</p><p>　　力學(xué)環(huán)境對(duì)骨折部位的新生血管形成一直受到關(guān)注。固定和血供是影響骨折愈合的兩大關(guān)鍵因素，固定為骨折斷端提供適當(dāng)?shù)木植苛W(xué)環(huán)境，血供的重建主要依靠新生血管的形成從而為骨折部位的愈合提供氧氣和營(yíng)養(yǎng)，這是大家很早就達(dá)成的共識(shí)。而力學(xué)環(huán)境對(duì)于新生血管

56、的調(diào)控作用，也逐漸得到研究者的關(guān)注，如Claes L 等對(duì)綿羊跖骨截骨模型的研究表明骨愈合過(guò)程中早期新生血管密度受骨固定的穩(wěn)定度[29]和骨斷端的間隙[31]的影響；Lienau J 等的研究也表明骨折端的機(jī)械穩(wěn)定保證了微血管的再生[32]；Choi IH 等研究了骨折端的微動(dòng)及牽張成骨對(duì)血管的再生及骨折愈合的促進(jìn)作用[33]；Miclau T 等研究發(fā)現(xiàn)骨折固定的穩(wěn)定性明顯影響骨折處間充質(zhì)細(xì)胞血管新生因子的表達(dá)[34]。</p&

57、gt;<p>　　另一研究力學(xué)刺激對(duì)新生血管形成影響較多的組織是骨骼肌。骨骼肌的收縮或拉張，會(huì)直接作用在肌肉組織中的血管上，刺激新生血管的形成。如Hoier B 等研究了運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練時(shí)人體骨骼肌中的剪切應(yīng)力和被動(dòng)張力將誘導(dǎo)肌纖維囊泡中的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子釋放并促進(jìn)毛細(xì)血管的形成[17]；Egginton S 對(duì)老鼠伸趾長(zhǎng)肌拉伸過(guò)載研究了肌肉血流與生長(zhǎng)因子及毛細(xì)血管形成的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)增加血流并不能促進(jìn)初始毛細(xì)血管床的形成，而拉伸則刺

58、激毛細(xì)血管清蛋白表面或上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞血管生成因子（ESAF）從而刺激毛細(xì)血管生長(zhǎng)[35]；Pufe T 等的研究表明肌腱滑移區(qū)域無(wú)血管的維持和發(fā)展可能是因?yàn)榱W(xué)原因誘導(dǎo)了血管新生抑制因子的更高表達(dá)[36]。</p><p>　　近年來(lái)，力學(xué)環(huán)境刺激組織工程材料的再血管化的研究越來(lái)越受到重視。組織工程的一個(gè)關(guān)鍵性難題就是組織支架材料的再血管化，從而為體外工程化培養(yǎng)組織提供血供。力學(xué)載荷對(duì)體外培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞等作用，將促

59、進(jìn)或抑制血管的形成。如Gould RA 等了組織三維培養(yǎng)下周期各向異性應(yīng)變對(duì)于血管間質(zhì)細(xì)胞表型和組織重建的影響，發(fā)現(xiàn)增加雙軸應(yīng)變各向異性將增加波形蛋白和平滑肌動(dòng)蛋白的表達(dá)，并促進(jìn)細(xì)胞的增殖和凋亡，而周期應(yīng)變將降低波形蛋白和平滑肌動(dòng)蛋白的表達(dá)[17]；Wilson CJ 等的研究也發(fā)現(xiàn)在周期應(yīng)變將破壞人工基質(zhì)中內(nèi)皮細(xì)胞網(wǎng)的形成[37]。</p><p>　　力學(xué)環(huán)境對(duì)其它新生血管形成模型中血管形成的影響研究相對(duì)較少

60、。如Baker AB 等用特制的力學(xué)載荷裝置拉伸小雞絨毛尿囊膜觀測(cè)新生血管形成，發(fā)現(xiàn)拉伸載荷將顯著地增加新生血管的數(shù)量[38]。Ichioka S 等用兔耳窗研究了血管剪應(yīng)力對(duì)傷口再生的影響，發(fā)現(xiàn)慢性血管舒張導(dǎo)致的血管剪應(yīng)力增大將刺激毛細(xì)血管的形成，增大毛細(xì)血管的密度[39]。</p><p>　　Baker AB 認(rèn)為，血管的整體響應(yīng)有可能與體外內(nèi)皮細(xì)胞的響應(yīng)相似[40]。在剪切力作用下細(xì)胞骨架變形，胞外基質(zhì)的

61、蛋白網(wǎng)變形和離子通道打開(kāi)，將使得內(nèi)皮細(xì)胞變形并沿力線方向排列[39]。Tranqui L 等提出，離體新生血管形成試驗(yàn)表明纖維蛋白凝膠基質(zhì)與細(xì)胞牽引力的耦合作用將觸發(fā)生物凝膠形成預(yù)圖式，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞形成毛細(xì)血管狀結(jié)構(gòu)網(wǎng)絡(luò)[41]。這樣，胞外基質(zhì)的力學(xué)環(huán)境將誘導(dǎo)和確定新生血管的形成方向[42]。在力學(xué)載荷的作用下，胞外基質(zhì)的纖維成分拉伸并將沿力線排列，而胞外基質(zhì)的非均勻性將誘導(dǎo)細(xì)胞沿載荷方向排列生長(zhǎng)。 這些研究表明環(huán)境對(duì)新生血管形成有著顯

62、著的調(diào)控作用[17-19]。通過(guò)文獻(xiàn)我們可以知道，目前的研究主要集中在兩個(gè)方面：一是力學(xué)環(huán)境對(duì)于血管數(shù)量和密度的直接影響，另一是力學(xué)環(huán)境作為始動(dòng)因素對(duì)于促進(jìn)或抑制新生血管形成的生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子等的調(diào)控。但骨折部位的力學(xué)環(huán)境非常復(fù)雜而難于準(zhǔn)確地觀測(cè)和定量分析新生血管所受到的力學(xué)載荷. </p><p>　　趙峰等最近用血管灌注micro-CT 成像技術(shù)在骨折愈合過(guò)程中的對(duì)該問(wèn)題進(jìn)行了探索，發(fā)現(xiàn)骨折固定的牢穩(wěn)程度對(duì)

63、血管的形成圖式有顯著影響[20,21]。趙峰等的一些動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，新生血管不僅在密度上對(duì)力學(xué)環(huán)境產(chǎn)生響應(yīng)，我、而且在形成的幾何形態(tài)圖式上有著更明顯的響應(yīng)，比如血管密度的分布圖式、新生血管的發(fā)生時(shí)間與隨時(shí)間的演化圖式、血管的分支和方向分布圖式、血管分布的維數(shù)等。我們知道，微血管網(wǎng)絡(luò)形態(tài)圖式的研究有著重要的生理和病理意義。連接微動(dòng)脈和微靜脈之間的微血管網(wǎng)是血管與周圍組織之間進(jìn)行物質(zhì)交換的場(chǎng)所，它的基本功能是在向各器官組織輸運(yùn)氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，

64、攜走代謝產(chǎn)物，調(diào)節(jié)組織的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。</p><p>　　1.4新生血管形成的研究方法</p><p>　　血管新生指的在成體血管上由已經(jīng)存在的成熟內(nèi)皮細(xì)胞沖破管壁基質(zhì)后遷移，增殖和重構(gòu)，以發(fā)芽的方式使血管分支持續(xù)延長(zhǎng)生成新的毛細(xì)血管。AG通常發(fā)生在胚胎生長(zhǎng)、傷口愈合、運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練等生理病理情況下[43]。</p><p>　　對(duì)于新生血管形成，傳統(tǒng)的研究方法主要有免疫

65、組織化技術(shù)、原位雜交技術(shù)、血管灌注Micro-CT成像技術(shù)。這幾種研究方法都各有優(yōu)缺點(diǎn)。如免疫組化技術(shù)具有特異性強(qiáng)、敏感性高、定位準(zhǔn)確等幾大優(yōu)點(diǎn)，缺點(diǎn)是過(guò)程復(fù)雜且沒(méi)法再活體上進(jìn)行。同樣，在研究DNA分子復(fù)制原理的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的原位雜交技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是具有很高的敏感性和特異性，可以在分子水平來(lái)探討細(xì)胞的功能表達(dá)及其調(diào)節(jié)機(jī)制，常用來(lái)評(píng)估調(diào)控血管生成的重要生長(zhǎng)因子的表達(dá)模式[44]，缺點(diǎn)依然是過(guò)程復(fù)雜且沒(méi)法再活體上進(jìn)行。近年來(lái)，隨著計(jì)算機(jī)生物醫(yī)

66、學(xué)成像技術(shù)的快速發(fā)展，逐漸建立的血管灌注Micro-CT成像技術(shù)為血管特別是微血管系統(tǒng)的三維幾何重建提供了一個(gè)行之有效的研究方案，這項(xiàng)技術(shù)能夠很精細(xì)地重建骨折愈合部位新生血管的發(fā)生和演化過(guò)程。Micro-CT成像技術(shù)最大的缺點(diǎn)是造影劑對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造成的致死傷害。換句話說(shuō)，Micro-CT成像技術(shù)對(duì)血管新生的研究是不連續(xù)的。目前有種造影劑在動(dòng)物體內(nèi)可以及時(shí)被代謝掉，但價(jià)格昂貴。另外，在使用Micro-CT機(jī)時(shí)會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)人員造成一定的身體損傷。

67、</p><p>　　對(duì)新生血管形成的研究已經(jīng)建立了一系列的在體和離體模型[45,46]，如角膜血管新生模型、 雞胚尿囊膜（Chorioallantoic membrane）血管生長(zhǎng)模型、斑馬魚(yú)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?、兔耳窗模型[47,48]等。在這些模型中，最突出的是兔耳窗模型。1924 年，Sandison 研究發(fā)明了第一個(gè)用在兔子耳朵內(nèi)植入的透明觀測(cè)窗，為在體研究細(xì)胞和組織行為提供了一種顯微觀測(cè)技術(shù)[47]。從那時(shí)起，這

68、種模式的各種改進(jìn)版本就被廣泛應(yīng)用于微循環(huán)形態(tài)研究和各種藥物對(duì)哺乳動(dòng)物組織的不良作用等。在Sandison的第一篇論文中，他闡明了三種類型耳窗的設(shè)計(jì)原則：兩個(gè)專門的窗子，一個(gè)為再生組織設(shè)計(jì)，一個(gè)為預(yù)成型組織設(shè)計(jì)；一個(gè)雙用途的的窗子包含了預(yù)成型和再生組織。他覺(jué)得這三種類型的窗子不僅通用且效率高。但是這些類型的窗子安裝比較困難因此沒(méi)有得到大范圍的適用。隨后Clark (1954),、Williams(1954)、Curri 和Tischend

69、orf (1953,1954)在論文中描述了一系列不同的設(shè)計(jì)修改和它們的一些應(yīng)用。</p><p>　　現(xiàn)在兔耳窗技術(shù)已經(jīng)是是新生血管形成的經(jīng)典在體觀測(cè)模型之一。Williams RG 曾對(duì)兔耳窗的原料和結(jié)構(gòu)進(jìn)行過(guò)較詳細(xì)的研究，認(rèn)為鉭（Tantalum）和云母片（做透明板用）是制作兔耳窗的最理想材料[48]。Clarke 等應(yīng)用免耳窗觀察了組織工程材料的再血管化的過(guò)程[49]。兔耳窗能清晰地在體區(qū)分新生血管，并在

70、顯微觀測(cè)下可實(shí)現(xiàn)微米級(jí)的毛細(xì)血管結(jié)構(gòu)重現(xiàn)，且由于其血管生長(zhǎng)區(qū)域僅50 微米厚，幾乎可以看成是二維的結(jié)構(gòu)。這為新生血管的觀察以及定量研究提供了極大的便利。</p><p>　　耳窗模式有很多優(yōu)點(diǎn)，比如兔耳窗是在動(dòng)物身上的長(zhǎng)期模式，并發(fā)癥如脫落或感染的發(fā)生概率較低，可以在不麻醉或按壓動(dòng)物的情況下進(jìn)行日常的拍照，并且不需要打開(kāi)窗子就能進(jìn)行定期觀察，可以連續(xù)觀察正在生長(zhǎng)的血管肉芽組織以及正在生長(zhǎng)的血管。兔耳窗的一些缺點(diǎn)也

71、被指出，主要的問(wèn)題是由于大多數(shù)耳窗是由透明的反射材料例如玻璃、丙烯酸樹(shù)脂或云母制成，導(dǎo)致兔耳窗中毛細(xì)血管宏觀照片的質(zhì)量并不令人滿意。通常不加處理而獲得的圖像對(duì)比度不高、邊緣不清晰并且存在耀斑。</p><p>　　1.4本文的立題思路和研究意義</p><p><b>　　1.4.1立題思路</b></p><p>　　整體上來(lái)說(shuō)，目前對(duì)于力學(xué)

72、環(huán)境對(duì)新生血管形成的影響的研究越來(lái)越受到關(guān)注，但仍處于探索階段，對(duì)于其機(jī)制的理解還相當(dāng)?shù)挠邢?。這些研究中，力學(xué)載荷對(duì)新生血管形成的影響主要體現(xiàn)在兩個(gè)方面，一是力學(xué)環(huán)境對(duì)于血管數(shù)量和密度的直接影響，另一是力學(xué)環(huán)境作為始動(dòng)因素對(duì)于促進(jìn)或抑制新生血管形成的生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子等的調(diào)控。不同的力學(xué)環(huán)境對(duì)于新生血管的形成有著不同的促進(jìn)或抑制作用。</p><p>　　對(duì)于力學(xué)環(huán)境影響新生血管形成的機(jī)制尚不清楚，而對(duì)于現(xiàn)象的研

73、究也僅限于骨折愈合部位的研究[20,21]。但由于骨折愈合過(guò)程中對(duì)新生血管的研究尚未能很好地解決兩個(gè)主要問(wèn)題：1）骨折部位的力學(xué)環(huán)境非常復(fù)雜，人體或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物的術(shù)后活動(dòng)很難控制，難于準(zhǔn)確地觀測(cè)和定量分析新生血管所受到的力學(xué)載荷，從而很難定量地評(píng)估力學(xué)刺激；2) 欲重建骨折愈合過(guò)程中的血管圖式形成，目前效果較好就是血管灌注Micro-CT 成像方法，可這種方法需在不同愈合時(shí)間處死大鼠，不能活體成像血管的三維結(jié)構(gòu)，不能準(zhǔn)確地把新生的血管從原有

74、血管中區(qū)分出來(lái)。</p><p>　　生理機(jī)制調(diào)節(jié)血管生成還沒(méi)有在活體上得到充分的研究。本文擬采用經(jīng)典的兔耳窗新生血管形成觀測(cè)技術(shù)[25,26]，在高倍顯微鏡的在體觀測(cè)下，更精細(xì)地觀測(cè)、區(qū)分和重現(xiàn)新生血管。在傳統(tǒng)的兔耳窗新生血管形成過(guò)程中，幾乎可近似地認(rèn)為血管僅受到血管內(nèi)的血流動(dòng)力學(xué)作用，受到外部組織的整體力學(xué)載荷為零。為了研究力學(xué)載荷對(duì)新生血管的影響，本課題在兔耳窗技術(shù)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)加工出一種新型兔耳窗植入兔耳

75、后，活體顯微鏡觀察血管新生，從而建立一套研究方法。再設(shè)計(jì)一種可施加載荷的新型兔耳窗，精準(zhǔn)地控制力學(xué)外載荷和精細(xì)地觀測(cè)新生血管的成過(guò)程，更深入地定量研究科學(xué)問(wèn)題：力學(xué)載荷如何影響新生血管的形成。</p><p><b>　　1.4.2研究意義</b></p><p>　　本課題擬研制一種新型的可施加力學(xué)載荷的兔耳窗裝置，以實(shí)現(xiàn)對(duì)兔耳窗中新生血管附著生長(zhǎng)的基底進(jìn)行加載。同

76、時(shí)，建立新生血管的形成定量描述指標(biāo)體系，定量探索不同力學(xué)加載下兔耳窗中血管形成影響。本課題的成功研究，將為進(jìn)一步的新生血管形成的機(jī)制研究提供現(xiàn)象描述和定量數(shù)據(jù)基礎(chǔ)，為一些生理和病理難題的解決提供思路，為臨床骨折的治療、皮膚修復(fù)和組織工程材料中再血管化的力學(xué)配置等提供理論支持。</p><p><b>　　1.4.3研究思路</b></p><p>　　本課題是在進(jìn)行充

77、分的文獻(xiàn)調(diào)研的基礎(chǔ)上開(kāi)始的，研究?jī)?nèi)容主要包括：首先，前期主要是在文獻(xiàn)調(diào)研的基礎(chǔ)上用不同材料對(duì)兔耳窗進(jìn)行設(shè)計(jì)。其次是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部分，主要是兔耳窗的植入實(shí)驗(yàn)和實(shí)驗(yàn)后兔子的飼養(yǎng)。再接著在確定的時(shí)間對(duì)兔耳窗進(jìn)行活體顯微鏡觀察，利用一個(gè)耦合到數(shù)位式彩色攝像機(jī)moticam 2000的Motic AE34倒置顯微鏡來(lái)觀察耳窗內(nèi)微血管，對(duì)新生血管圖像進(jìn)行采集。最后通過(guò)Mathworks公司的Matlab R2012a軟件對(duì)獲取得到的圖像進(jìn)行分析處理。

78、 </p><p>　　圖1.2兔耳窗裝置植入手術(shù)流程圖</p><p>　　2兔耳窗的設(shè)計(jì)及植入實(shí)驗(yàn)</p><p>　　要探究拉伸載荷對(duì)血管新生的影響，首先要建立兔耳窗模型，為后期新生血管圖像的獲取提供條件。本節(jié)將詳細(xì)敘述兔耳窗的設(shè)計(jì)、兔耳窗的安裝實(shí)驗(yàn)和兔子的飼養(yǎng)等方面的細(xì)節(jié)和注意事項(xiàng)。</p><p><b>　　2.

79、1兔耳窗的設(shè)計(jì)</b></p><p>　　耳窗裝置由以下部分組成：</p><p>　　1）基板:厚1mm，直徑為24mm的塑料圓板?；宓闹苓叢坑腥齻€(gè)外穿小孔（直徑2mm），用來(lái)固定窗子?；逯行牟课挥么蚩灼鲾U(kuò)出一個(gè)直徑約為15mm的外穿大孔，簡(jiǎn)稱中心孔。在活體顯微鏡觀察時(shí)中心孔可以透光，有助于成像。</p><p>　　2）蓋片：與基板形狀相同的透

80、明云母片和硅膠片。蓋片周圍有與兩基板相對(duì)應(yīng)的3個(gè)外穿小孔。蓋片直接與耳朵兩側(cè)的軟骨組織相接觸。</p><p>　　3）蓋板：和基板相同，厚1mm，直徑為24mm的塑料圓板。蓋板的周邊部也有三個(gè)相對(duì)應(yīng)的外穿小孔（直徑2mm），蓋板中心部位也有用打孔器擴(kuò)出的直徑約為15mm的中心孔。</p><p>　　4）墊圈：外徑4mm，內(nèi)徑3mm，厚0.3mm的硅膠圓環(huán)。墊圈穿過(guò)螺絲放在蓋片和耳朵之間

81、，用來(lái)以增加蓋片與耳朵組織之間的空隙，使免耳窗裝置置入后不影血液循環(huán)，有利于耳窗內(nèi)組織的生長(zhǎng)。</p><p>　　5)直徑1mm的螺絲3個(gè)，相應(yīng)螺絲帽3個(gè)。</p><p>　　圖2.1 耳窗的組成部分：（a）基板；（b）蓋板；（c ）蓋片；（d）墊圈；（e）螺絲和螺母</p><p>　　圖2.2 安裝好的耳窗裝置</p><p>　　2

82、.2兔耳窗的植入實(shí)驗(yàn)</p><p><b>　　2.2.1實(shí)驗(yàn)分組</b></p><p>　　本實(shí)驗(yàn)用到的動(dòng)物是體重2.0~2.5kg的日本大耳白兔（購(gòu)于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部）。兔子購(gòu)買回來(lái)后，首先進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)3-5天，待兔子熟悉飼養(yǎng)環(huán)境，情緒穩(wěn)定后即可進(jìn)行耳窗安裝手術(shù)。分別用不同材料（云母和硅膠）的蓋片組裝好兔耳窗。硅膠拉伸產(chǎn)生形變可對(duì)預(yù)成型組織產(chǎn)生外加力

83、學(xué)載荷。本課題中硅膠的拉伸形變?yōu)?0%。</p><p><b>　　表2.1 實(shí)驗(yàn)分組</b></p><p>　　2.2.2兔耳窗的植入</p><p>　　實(shí)驗(yàn)用品及手術(shù)器械：1%的戊巴比妥鈉溶液、生理鹽水、青霉素鈉、止血棉、注射器、打孔器、眼科剪、攝子、剪刀、鉗子、鐵絲、鐵鏈、塑料扎帶和兔子固定箱等。</p><p&

84、gt;<b>　　手術(shù)步驟：</b></p><p>　　1）麻醉。小心地把兔子放在一個(gè)專門定制的固定箱中，限制它的活動(dòng)并安撫兔子，待其安靜不掙扎時(shí)即可麻醉。麻醉前用沾有酒精的棉花擦拭右耳耳沿靜脈，使血管充盈變粗從而利于進(jìn)針注射麻醉劑。在右耳耳沿靜脈上用3%戊巴比妥鈉溶液麻醉（劑量為30-35mg/kg）。麻醉后剃去耳朵兩側(cè)的兔毛，消毒耳部皮膚。</p><p>　　

85、2）選擇耳廓近末梢的部位開(kāi)窗。在欲開(kāi)窗相應(yīng)部位用打孔器穿過(guò)軟骨和皮膚打出三個(gè)直徑為2.5mm的外穿孔。外穿孔的尺寸和位置以匹配圓盤和周邊柱腳為基準(zhǔn)，用來(lái)固定耳窗。打孔時(shí)盡量選擇沒(méi)有大血管的部位，切勿傷及較大的血管。</p><p>　　3）在耳廓內(nèi)面，三個(gè)小外穿孔的中央部位，用打孔器打出一個(gè)直徑為5mm的外穿孔，為中央孔。用眼科剪小心地切開(kāi)并剝離外穿孔周圍一圈的皮膚(表皮與真皮)，剝離的寬度為2mm左右。暴露出真

86、皮下的軟骨。</p><p>　　4）安裝。暴露出皮下軟骨要后迅速安裝耳窗裝置。將基板安置在耳郭內(nèi)面，蓋片和耳窗環(huán)固定于耳廓的外面。在3個(gè)小孔處安裝螺絲。置入耳窗置前，噴灑青霉素。置入耳窗裝置后，在其周圍涂以消炎軟膏。</p><p>　　5）固定四肢。兔耳窗裝置安裝好后，用塑料扎帶綁好兔子的四肢，再用細(xì)軟鐵絲分別將前肢和后肢的兩個(gè)扎帶串綁好。前肢鐵絲長(zhǎng)度為15-18cm，后肢鐵絲的長(zhǎng)度要

87、略大于前肢，為18-20cm。這么做的目的是防止在組織愈合過(guò)程中兔子由于瘙癢或者疼痛而用后/前肢拍打耳朵，從而保護(hù)耳窗裝置。</p><p>　　圖2.3耳沿靜脈注射麻醉劑</p><p>　　圖2.4剝離表皮和真皮，暴露皮下軟骨</p><p>　　圖2.5植入兔耳的耳窗裝置</p><p>　　2.3實(shí)驗(yàn)后兔子的飼養(yǎng)</p>

88、<p>　　兔耳窗安裝好后，兔子尚未清醒，小心地將其放在兔籠中。在水槽中放好清水，食槽中放好兔糧，待其醒來(lái)飲食。兔籠的大小以兔子能在其內(nèi)自由轉(zhuǎn)身為適。兔糧購(gòu)于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部。兔子在溫控室內(nèi)恒溫飼養(yǎng)，每天早中晚各換水一次，喂食一次，每次喂食不宜過(guò)多。喂食量可以在最開(kāi)始由兩次喂食之間兔子吃下的飼料量來(lái)定。一般來(lái)說(shuō)，晚上較早晨和中午應(yīng)多喂食。</p><p>　　每天早晚各打掃一次兔籠衛(wèi)生。兔籠應(yīng)

89、保持干燥并及時(shí)清理兔子身上掉落的兔毛，處理兔子排出的糞便，保證兔籠干凈衛(wèi)生。</p><p>　　每次活體顯微鏡觀察時(shí)，抓兔子的動(dòng)作盡量輕柔。一來(lái)可以防止對(duì)兔子產(chǎn)生驚嚇，二來(lái)可以避免對(duì)兔子造成不必要的傷害。用手抓住兔子的后背將其從兔籠中提出，小心地用另一只手拖住兔子的后肢，形成一個(gè)抱的姿勢(shì)安撫它直到其平靜不掙扎。</p><p><b>　　2.4小結(jié)</b><

90、/p><p>　　本節(jié)首先論述了兔耳窗的詳細(xì)設(shè)計(jì)，介紹了實(shí)驗(yàn)分組，以及詳細(xì)描述了將不同材料蓋片組成的兔耳窗裝置植入到兔耳內(nèi)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)手術(shù)。最后介紹了有關(guān)兔子在實(shí)驗(yàn)手術(shù)后的飼養(yǎng)。</p><p><b>　　2.5討論</b></p><p>　　耳窗植入手術(shù)是活體顯微鏡觀察新生血管之前的重要環(huán)節(jié)。因此需要實(shí)驗(yàn)者在手術(shù)前熟悉一些外科手術(shù)相關(guān)的知識(shí)。在

91、手術(shù)時(shí)如果損傷組織較重，擠壓、挫傷血管，都可能會(huì)影響微血管的功能及恢復(fù)。無(wú)菌操作不嚴(yán)密，從而造成炎癥反應(yīng)，也會(huì)妨礙實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行。所以，所有操作都必須在無(wú)菌環(huán)境下進(jìn)行。在術(shù)中微血管損傷可出現(xiàn)以下三種情況：</p><p>　　1）出血。剝離表皮和真皮時(shí)，可能會(huì)損傷穿過(guò)軟骨的2~3條小血管，從而造成耳窗內(nèi)積血，影響后期的活體顯微鏡的觀察。</p><p>　　2）微血管受到擠壓。這種情況可能是手

92、術(shù)中一時(shí)性壓迫，也可能是是安裝耳窗裝置過(guò)緊所致。</p><p>　　3）損傷血管壁。這種損傷大多是肉眼不可見(jiàn)的損傷。血管收縮時(shí)受損處膨大，使血管呈念珠狀。因此，手術(shù)時(shí)操作必須仔細(xì)，輕柔，盡量避免機(jī)械性擠壓。</p><p>　　另外在麻醉時(shí)，注射麻醉劑的速度一定要適當(dāng)，不能太快也不能太慢。在本課題的進(jìn)行中，第一只兔子就不幸被麻醉致死。在請(qǐng)教老師、查找相關(guān)文獻(xiàn)近一周后才發(fā)現(xiàn)是由于在麻醉時(shí)進(jìn)

93、藥過(guò)快導(dǎo)致的。這么一耽擱嚴(yán)重影響了試驗(yàn)進(jìn)度。通過(guò)后來(lái)的實(shí)驗(yàn)摸索，探究得出使用3%的戊巴比妥鈉麻醉兔子，最佳的劑量是30-35mg/kg，最佳的進(jìn)藥速度是0.1ml/s。</p><p>　　兔子是一種很溫順的動(dòng)物。雖然有一種說(shuō)法“兔子急了還咬人”，但是要意識(shí)到兔子是不會(huì)輕易“急”的。所以在做有關(guān)兔子的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)時(shí)，第一想法不是要想怎么防止被兔子咬，而是應(yīng)該想怎么抓兔子才不會(huì)對(duì)它身體造成損傷。傳統(tǒng)的抓法如拎兔耳、抓兔

94、頸在一定程度上都會(huì)對(duì)兔子身體造成損傷。特別是本項(xiàng)目需要研究兔子耳朵上的新生血管，對(duì)兔子耳朵的保護(hù)應(yīng)該更加得到重視。</p><p>　　3新生血管圖像的采集和分析</p><p>　　術(shù)后從第7天到第15天，每2天用一個(gè)耦合到數(shù)位式彩色攝像機(jī)moticam 2000的Motic AE34倒置顯微鏡來(lái)觀察耳窗內(nèi)微血管。耳窗內(nèi)組織的透照是在一個(gè)150瓦的鹵素投影燈（飛利浦）協(xié)助下完成的。<

95、;/p><p>　　3.1耳窗的愈合 </p><p>　　在我們的實(shí)驗(yàn)中，耳窗的愈合無(wú)沒(méi)有產(chǎn)生并發(fā)癥，并且預(yù)成型組織的生命力表現(xiàn)得很好。組織生長(zhǎng)發(fā)生在總體空間的中央薄層上。通常在手術(shù)完的后幾天觀察不到有明顯的血管生長(zhǎng)。中央孔和蓋片的縫隙間充滿著傷口分泌的組織液。隨著組織適應(yīng)了新的環(huán)境和封閉的表面，軟骨膜結(jié)締組織層也逐漸變得更加透明。</p><p>　　在大多數(shù)情

96、況下，耳窗內(nèi)有著毛細(xì)血管床的組織生存時(shí)間較長(zhǎng)，這樣就為短時(shí)間及長(zhǎng)時(shí)間的觀察提供了可能性。</p><p>　　3.2活體顯微鏡觀察</p><p>　　活體顯微鏡檢查法是一種功能強(qiáng)大的光學(xué)成像技術(shù)，它可以非侵入性的監(jiān)測(cè)完好活體組織內(nèi)的分子和細(xì)胞過(guò)程，分辨率達(dá)到了1-10毫米。復(fù)雜的動(dòng)物模型，如窗口模式是這一技術(shù)的先決條件。</p><p>　　在研究中，動(dòng)物一般四肢

97、展開(kāi)綁好，仰臥放置在固定板上。毋庸置疑的是，雖然動(dòng)物可以通過(guò)訓(xùn)練使自己適應(yīng)這樣的固定方式，但是真這樣的話就不可避地引入了應(yīng)力因素。而且仰臥姿勢(shì)在生理學(xué)上說(shuō)很難長(zhǎng)時(shí)間保持。為了消除這些潛在的誤差來(lái)源，我們?cè)谟^察的時(shí)候使兔子以正常的姿勢(shì)蹲伏在一固定箱中。同時(shí)它整個(gè)的背面與頸背頸部都用帶子綁好并支撐好頭部。固定沒(méi)有造成耳朵產(chǎn)生任何壓縮或扭曲。換句話說(shuō)兔子是允許一些自由活動(dòng)，只要它的活動(dòng)不對(duì)兔耳窗的位置產(chǎn)生干擾。在進(jìn)行活體顯微鏡檢查時(shí)只需將固定

98、箱放好，把兔耳窗放置在載物臺(tái)上即可。</p><p>　　我們使用一臺(tái)倒置顯微鏡（麥克奧迪公司，Motic AE34）來(lái)對(duì)兔耳窗進(jìn)行觀察。顯微鏡的操作主要分為以下幾步：首先，接連電源----開(kāi)機(jī)----打開(kāi)鏡體下的電控開(kāi)關(guān)。</p><p>　　1）預(yù)備：將待觀察的兔耳窗置于載物臺(tái)上。旋轉(zhuǎn)三孔轉(zhuǎn)換器，選擇放大4倍的物鏡觀察，然后調(diào)節(jié)鉸鏈?zhǔn)诫p目目鏡，動(dòng)作輕緩。</p><

99、p>　　2）調(diào)節(jié)光源：通過(guò)推拉適度調(diào)節(jié)鏡體下整個(gè)亮度。然后通過(guò)調(diào)節(jié)聚光鏡下面的光柵來(lái)調(diào)節(jié)光源的大小。</p><p>　　3）調(diào)節(jié)像距：選擇并更換合適的目鏡；同時(shí)對(duì)升降進(jìn)行調(diào)節(jié)，以進(jìn)一步消除影像附近的光暈，同時(shí)進(jìn)步影像的襯度。</p><p>　　4）觀察：通過(guò)目鏡進(jìn)行觀察；首先應(yīng)調(diào)整載物臺(tái)，選擇較好的觀察視野。先調(diào)節(jié)粗準(zhǔn)焦螺旋，再調(diào)節(jié)細(xì)準(zhǔn)焦螺旋使視野內(nèi)成像清晰。</p>

100、<p>　　5）觀察結(jié)束后：關(guān)機(jī)并取下兔耳窗，推拉光源亮度調(diào)節(jié)器，調(diào)至最暗。然后封閉鏡體下真?zhèn)€開(kāi)關(guān)，同時(shí)斷開(kāi)電源。最后旋轉(zhuǎn)三孔轉(zhuǎn)換器，使物鏡鏡片置于載物臺(tái)的下側(cè)，以更好地防止灰塵的沉降。</p><p>　　圖3.1 倒置顯微鏡和輔助光源</p><p>　　3.2新生血管圖像的采集</p><p>　　術(shù)后從第7天到第15天，每2天用一個(gè)耦合到數(shù)位式

101、彩色攝像機(jī)moticam 2000的Motic AE34倒置顯微鏡來(lái)觀察耳窗內(nèi)微血管。耳窗內(nèi)組織的透照是在一個(gè)150瓦的鹵素投影燈（飛利浦）協(xié)助下完成的。</p><p>　　在一臺(tái)個(gè)人電腦上（lenovo V460）預(yù)先安裝好Motic Images Advanced 3.2軟件。采集圖像時(shí)，先將連接在電腦上的moticam 2000（2.0M pixel）裝置放在倒置顯微鏡的**中。通過(guò)肉眼在目鏡中調(diào)節(jié)好清晰

102、的圖像后把目鏡下方的模式調(diào)節(jié)按鈕調(diào)節(jié)到PHOTO選項(xiàng)。在軟件Motic Images Advanced 3.2準(zhǔn)備采集圖像。</p><p>　　軟件Motic Images Advanced 3.2的操作步驟為：</p><p>　　1）點(diǎn)擊右上方任務(wù)欄的文件選項(xiàng)，出現(xiàn)下拉菜單，再點(diǎn)擊采集窗選項(xiàng)，系統(tǒng)將跳出motic動(dòng)態(tài)成像窗口。</p><p>　　2）點(diǎn)擊窗口

103、左側(cè)第四個(gè)“照相機(jī)”圖案，右側(cè)的矩形框中將出現(xiàn)肉眼在目鏡中看到的圖像。</p><p>　　3）微微調(diào)節(jié)載物臺(tái)上兔耳窗的位置，選好合適的角度，點(diǎn)擊中間選項(xiàng)框中的拍照按鈕，系統(tǒng)自動(dòng)將右側(cè)矩形框中的圖像記錄下來(lái)。更換角度，多次拍攝。</p><p>　　4）關(guān)閉motic動(dòng)態(tài)成像窗口，在軟件Motic Images Advanced 3.2主界面最右側(cè)，選擇比較清晰的圖像單擊放大觀察。若圖像質(zhì)

104、量比較理想，點(diǎn)擊右上方任務(wù)欄的文件選項(xiàng)，出現(xiàn)下拉菜單，再點(diǎn)擊存儲(chǔ)為選項(xiàng)，跳出窗口后，選擇目標(biāo)文件架，更改文件名，確定保存類型。本項(xiàng)目采集到的圖像一律設(shè)置為tiff圖像格式。</p><p><b>　　圖3.2采集窗</b></p><p>　　圖3.3motic動(dòng)態(tài)成像模塊</p><p>　　圖3.4各時(shí)期各材料兔耳窗內(nèi)的新生血管圖像（圖A

105、、B、C分別是是云母蓋片組在第3、10、15天的圖像；圖D、E、F分別是硅膠蓋片組在第3、10、15天的圖像；圖G、H、I分別是拉伸硅膠蓋片組在第3、10、15天的圖像）</p><p>　　3.3新生血管圖像的分析</p><p>　　在一臺(tái)個(gè)人電腦上（lenovo V460）預(yù)先安裝好Matlab R2012a軟件。MATLAB是美國(guó)MathWorks公司出品的商業(yè)數(shù)學(xué)軟件，用于算法開(kāi)

106、發(fā)、數(shù)據(jù)可視化、數(shù)據(jù)分析以及數(shù)值計(jì)算的高級(jí)技術(shù)計(jì)算語(yǔ)言和交互式環(huán)境，主要包括Matlab和Simulink兩大部分。MATLAB配有功能強(qiáng)大、專業(yè)函數(shù)豐富的圖像處理工具箱，是進(jìn)行圖像處理方面工作必備的軟件工具，應(yīng)用非常之廣泛。</p><p>　　測(cè)定總血管床的投影面積來(lái)定量分析的新生血管的數(shù)量。第15天的時(shí)候?qū)@得的圖像數(shù)字化。將圖像轉(zhuǎn)換產(chǎn)生二值圖像，即在黑色背景中顯示白色血管（圖）。白（血管）的灰度級(jí)值（ I