食品科學與工程畢業(yè)論文脈紅螺多糖提取工藝研究

1、<p><b>　　本科畢業(yè)論文</b></p><p><b>　?。?0 屆）</b></p><p>　　脈紅螺多糖提取工藝研究</p><p>　　所在學院 </p><p>　　專業(yè)班級 食品科學與工程

2、 </p><p>　　學生姓名 學號 </p><p>　　指導教師 職稱 </p><p>　　完成日期 年 月 </p><p><b>　　目錄</b></p>

3、<p>　　[摘要]本文主要研究從脈紅螺中提取多糖的方法優(yōu)化。通過苯酚-硫酸顯色法，比照葡萄糖標準曲線計算多糖量。在采用單因素分析(提取時間、料液比、提取溫度)的基礎上結合正交試驗，優(yōu)化脈紅螺多糖提取的條件。最后得到脈紅螺的最佳提取條件為：提取溫度50℃、料液比1：80、提取時間1h。樣品回收率在82.11％～109.97％之間。</p><p>　　[關鍵詞]脈紅螺；多糖；苯酚-硫酸法；正交試驗&

4、lt;/p><p>　　Extraction Process of Polysaeeharides </p><p>　　from Rapana venosa Valenciennes </p><p>　　[Abstact]This paper mainly studies the Methods optimize of polysaccharide extrac

5、tion from Rapana venosa Valenciennes. Calculation the content of polysaccharide through Phenol-sulfuric acid colorimetry and glucose Standard curve. using single factor analysis(extraction time、solid to solvent ratio、ext

6、raction temperature) , then,using orthogonal analysis, optimized extraction conditions. Finally got the Best extraction conditions of Rapana venosa Valenciennes: extraction temperature is 50℃; solid t</p><p>

7、;　　[Key words]Rapana venosa Valenciennes; Polysaeeharides; Phenol-sulfuric acid colorimetry ;orthogonal experiment</p><p><b>　　1前言</b></p><p>　　脈紅螺（Rapana venosa Valenciennes）又名角泊螺，軟

8、體動物門腹足綱。螺殼表面為黃褐色，有棕色斑點和色帶密生低而均勻的螺肋，向外突出形成肩骨，螺旋部小，體螺層膨大成體殼高11-12cm。脈紅螺主要在我國福建以北沿岸廣為分布，舟山海域均有發(fā)現(xiàn)。脈紅螺幼螺多分布在低潮線附近巖石間，成螺一般多棲息在潮下帶數(shù)米至數(shù)十米深的細泥、碎殼的海底。脈紅螺足部特別肥大、味美、營養(yǎng)豐富[1]。</p><p>　　多糖 (polysaccharide)是指10個以上單糖分子通過糖苷鍵連

9、接的高分子聚合物，可以包括幾百甚至幾千個單糖分子。多糖廣泛存在于自然界中的動物、植物、微生物和海洋生物等機體內，既是生物體的貯能物質，也是生物體的結構物質，還參與多種重要的生命活動。多糖不是一種純粹的化學物質，而是聚合程度不同的物質的混合物。多糖類一般不溶于水，沒有甜味，不能結晶，無還原性和變旋現(xiàn)象。多糖也是糖苷，所以可以水解，在水解過程中，往往產生一系列的中間產物，最終完全水解得到單糖。來源于海洋動、植物及微生物中的多糖稱為海洋多糖,

10、大多數(shù)的海洋多糖具有生物活性,如增強免疫調節(jié)、降血糖、調血脂、抗病毒、抗腫瘤、抗凝血、抗衰老、抗炎等[2]，因此，具有開發(fā)成為保健食品、藥物、載體材料[3]等應用在醫(yī)藥衛(wèi)生領域的潛力。</p><p>　　1.1多糖的功能 </p><p>　　1.1.1 抗凝血作用</p><p>　　Volk等[4]據(jù)報道產自Cyanobacteria的非硫酸化的多糖（RP

11、Ss）具有抗凝血活性，原產于S.aquatilis的硫酸化多糖RPS則具有抗凝血作用,其強度和墨角藻聚糖相當,弱于肝素。據(jù)研究牡蠣多糖在臨床上對于促進傷口愈合和缺血部位的血管生成具有重要的應用價值。[5]Matou等[6]報道,海中的可變單胞菌A.infernussp.產生的胞外多糖化學修飾產物高硫酸化胞外多糖(OS- EPS)具有促進血管生的生成，并有降低抗凝血活性的作用。</p><p>　　1.1.2 抗輻

12、射作用</p><p>　　黑木耳多糖具有抗放射作用，對Co[7]照射的動物可提高存活率。楊明亮，黃曉蘭等[8]的研究表明長期注射海帶多糖的Wistar大鼠，在一次性全身照射γ射線后，體內體液免疫、細胞免疫、非特異性免疫相關指標及脾淋巴細胞凋亡率均比未注射的Wistar大鼠更好。</p><p>　　研究結果表明:螺旋藻水溶性多糖能顯著增強輻射引起的DNA的切除修復活性和程序外DNA合成。

13、同時能顯著減輕小鼠骨髓細胞和蠶豆根尖細胞的輻射遺傳損傷，大大降低輻射引起的突變頻率。</p><p>　　1.1.3降血糖、降血脂</p><p>　　植物多糖能夠促進胰島分泌胰島素，影響糖代謝酶的活性，促使組織對葡萄糖的作用，從而抑制糖異生。其降血糖作用主要表現(xiàn)在降低肝糖原、促進外周組織器官對糖的利用；促進降糖激素和抑制升糖激素作用；保護胰島細胞；以及調節(jié)糖代謝酶活性等方面[9]Giro

14、la等[10]研究發(fā)現(xiàn)殼多糖可降低血中總膽固醇，低密度脂蛋白膽固醇和甘油三酯的含量，提高高密度脂蛋白膽固醇的含量。藥理實驗證明，茶多糖具有明顯的降血糖的作用，其中有降血糖作用的多糖為牛乳葡聚糖[11]。</p><p>　　1.1.4抗炎、抗疲勞作用</p><p>　　研究結果表明，一些多糖具有抗炎作用。泥鰍多糖的抗炎效果與地塞米松并沒有顯著差別，甚至有的作用還略強于地塞米松磷酸鈉注射液

15、，并且呈一定的量效關系。河蚌多糖 (Mpa) [12]對甲醛引起的大鼠的足拓反應以及二甲苯引起的小鼠耳廓腫脹，具有明顯不同程度的抗炎作用，且對慢性炎癥效果更好，因此可證明MPa的抗炎機理不是直接作用的，很可能通過機體調整炎癥病灶生理變化或抑制致炎因子的產生而緩慢發(fā)揮作用的。余宗陽、王文武等[13]人對香茹多糖抗炎作用的研究表明：香菇多糖能明顯抑制二甲苯性小鼠耳腫脹、顯著拮抗雞蛋清致小鼠足趾腫脹和濾紙片所誘導的肉芽組織增生。近年來已證實具

16、有抗疲勞作用的動物多糖有：鮑魚多糖、鱉多糖、殼聚糖。研究表明，殼聚糖具有極顯著的抗疲勞活性，殼聚糖能顯著延長小白鼠負重游泳時間，能有效減少運動機體里乳酸的堆積，并且能夠迅速消除堆積的乳酸，增強有氧代謝耐的能力，提高小白鼠機體運動能力，從而延緩小鼠機體疲勞的發(fā)生并加速疲勞的恢復。鮑魚多糖在調節(jié)免疫、抗炎亦有十分明顯的功效。從鮑魚皺紋盤鮑中提取物，能明顯增加小鼠吞噬細胞的吞噬能力，增強遲發(fā)超敏反應，延長小鼠的生命力。</p>

17、<p><b>　　1.2多糖的提取</b></p><p>　　1.2.1動物多糖的提取</p><p>　　動物多糖幾乎存在于動物所有的組織器官中，主要存在于細胞間質中，在機體中的分布不均一，隨組織類型而定。</p><p>　　對于動物多糖的提取經常采用乙醚、甲醇、丙酮等先進行預處理，其主要目的是脫脂[14]。脫脂后的物質或是不

18、需要脫脂的原料常用水作溶劑來提取多糖，近年來大都采用堿提取法[15 16]或蛋白酶水解法和水解酶消化法[17 18]，也有用超聲波等方法來提取，在最大限度減少多糖損失的前提下，提高多糖提取率。用水及中性鹽溶液提取較溫和，適用于透明質酸等不含硫酸基多糖的提取(因為硫酸基經堿處理后易發(fā)生Walden轉化或形成36一內醚衍生物而發(fā)生脫硫現(xiàn)象)。稀堿液提取法適用于多糖與蛋白質間結合型的轉化，堿提取法是基于蛋白多糖中的糖膚鍵對堿的不穩(wěn)定性，提取過

19、程應在溫和條件下，以避免氨基多糖的堿降解。蛋白酶水解法是提取動物多糖的理想方法，蛋白酶作用的膚鍵范圍廣泛，使蛋白質充分水解。除蛋白的技術主要應用于動物多糖的提取，因用水或鹽溶液提取可得到大部分與蛋白質結合的粘多糖，可用酶降解蛋白質部分或用堿使多糖蛋白質間的鍵裂開以促使粘多糖在提取時的溶解。</p><p>　　1.2.2植物多糖的提取</p><p>　　水提淳沉法是植物多糖提取中最常用的

20、方法。多糖常與其他分子共存于植物中，可利用多糖不溶于有機溶劑的性質在提取液中加入乙醇等使多糖從提取液中沉淀出來，到達初步分離純化的目的。在此基礎上，為改進水提醇沉法，而采用一些輔助方法。如：微波輔助提取，楊性民等采用比較試驗證明微波輔助法提取率明顯高于單純水提法[19]；有研究者采用超聲波輔助提取多糖，超聲技術應用于植物細胞壁破裂，大大加快了反應速度，有效提高了收率。趙文彬等[20]利用超聲技術提取天山大黃多糖，在35KHz超聲他提取4

21、0min后，經過濾，濃縮，醇沉等工藝，多糖提取率達8.756% ；細胞壁的主要成分是纖維素，利用酶恰當處理，可是細胞壁軟化、膨脹和崩潰，改變其通透性，提高細胞內含物的溶出。</p><p>　　2 實驗材料、主要儀器與試劑</p><p><b>　　2.1 實驗材料</b></p><p>　　脈紅螺干粉的制備：本實驗研究脈紅螺全臟器的提取率

22、，活體脈紅螺（購置于舟山南珍菜場），洗凈去殼，控干水分后放入高速組織搗碎機搗碎，分別用等體積的丙酮和95%的乙醇浸泡10小時和2小時，出去濾液后放置于40℃的烘箱中干燥，粉碎后過60目篩，裝于密封袋中，放置冰箱備用。</p><p><b>　　2.2 主要儀器</b></p><p>　　儀器名稱 型號

23、 廠家</p><p>　　高速組織搗碎機 山海標本磨具廠</p><p>　　紫外分光光度計 UV-1100 上海美譜達儀器有限公司</p><p>　　干燥箱

24、 DGG-9240A 電熱恒溫干燥箱</p><p>　　手提式高速萬能粉碎機 DTF-250 溫嶺市林大機械廠</p><p>　　飛鴿牌離心機 TDL-40B 上海安亭科學儀器廠</p><p>　　電子天平

25、 賽多利斯科學儀器有限公司</p><p>　　數(shù)顯恒溫水浴鍋 HH-4 常州澳華儀器有限公司</p><p><b>　　2.3主要試劑</b></p><p>　　試劑（規(guī)格）

26、 廠家</p><p>　　濃硫酸 (分析純AR) 國藥集團化學試劑有限公司</p><p>　　苯酚 (分析純AR) 國藥集團化學試劑有限公司</p><p>　　丙酮 (分析純AR)

27、 國藥集團化學試劑有限公司</p><p>　　乙醇 (分析純AR) 國藥集團化學試劑有限公司）</p><p>　　碳酸鈉 (分析純AR)</p><p>　　苯酚為重餾酚，稱取 100g苯酚，0.05g碳酸氫鈉和0.1g鋁片，置圓底燒瓶中加熱蒸餾，收集180～182℃的餾分[21]</

28、p><p>　　5%苯酚溶液制備：準確稱取5g苯酚于干燥燒杯中，加一定量的蒸餾水溶解后移入100ml的棕色容量瓶中，加蒸餾水定容后得到5%苯酚。</p><p>　　活性炭的活化：去一定量得活性炭加入2g/mlHCl溶液，置于35℃水浴鍋30分鐘后抽濾，加蒸餾水洗滌，直至PH5～6。放置于150℃的馬弗爐中烘干5小時。</p><p>　　1%NaOH料液的配置，精確稱

29、取干燥NaOH10g至于大燒杯中，加入1000g蒸餾水，攪拌溶解后備用。</p><p><b>　　3 實驗內容</b></p><p><b>　　3．1 苯酚硫酸法</b></p><p>　　苯酚-硫酸法是利用多糖在硫酸的作用下先水解成單糖，并迅速脫水生成糖醛衍生物，然后與苯酚生成橙黃色化合物。在波長490nm以比

30、色法測定其吸光度，再同葡萄糖標準曲線比較，確定其濃度值。</p><p>　　3.2葡萄糖標準曲線的制備</p><p>　　精密稱取105℃干燥至恒重的葡萄糖標準品 20mg，置 500l容量瓶中加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，配得40 μg/ml的葡萄糖標準溶液。精密吸取葡萄糖標準溶液0.2、0.4、0.8、.2、1.6ml，分別置于10mL具塞刻度試管中，各以水補至 2.0ml，然后分別

31、加入5%苯酚溶液 1ml，搖勻，迅速加入 5ml濃硫酸，放入沸水中 15min，取出置冷水中冷卻 30min，以 2ml的蒸餾水按同樣顯色操作作為空白，用紫外分光光度計在490nm處測定吸光度。以吸光度A值為縱坐標，葡萄糖濃度為橫坐標繪制標準曲線。[22]</p><p>　　3.3苯酚硫酸法測定脈紅螺多糖波長</p><p>　　精密吸取0.2、0.4、0.8、1.2、1.6ml由10m

32、l脈紅螺蒸煮液定容到100ml的溶液經過苯酚硫酸法處理后，在400～600nm范圍內進行光譜掃描，選擇其最大吸收峰波長。</p><p>　　3.3.1脈紅螺蒸煮液去色和未去色的波普對比</p><p>　　分別稱取1g脈紅螺干粉按相同的方法條件蒸煮后離心取上清液，一份加入一定量的活性炭去色，另外一份保持原樣不作處理。分別取去色和未去色的脈紅螺蒸煮液各1.2ml 1.6ml用蒸餾水定容到8

33、ml后測吸光度，觀察色素對脈紅螺吸收峰有無影響。</p><p>　　3.4脈紅螺多糖提取的單因素試驗</p><p>　　本次試驗分別考察了提取時間、提取溫度、料液比對脈紅螺總糖得率的影響。</p><p><b>　　3.4.1料液比</b></p><p>　　稱取脈紅螺干粉五分各1g，分別按料液比1:20、1:4

34、0、1:60、1:80、1:100，在70℃下水浴2h，置于高速離心機3000r/min，離心十分鐘，取上清液。按苯酚硫酸法測定脈紅螺多糖的濃度，分析料液比對脈紅螺多糖得率的影響。</p><p>　　3.4.2 提取溫度</p><p>　　稱取脈紅螺干粉五分各1g，按料液比(W/V)1:80，分別在40、50、60、70、80℃下水浴2h，置于高速離心機3000r/min，離心十分鐘，

35、取上清液。按苯酚硫酸法測定脈紅螺多糖的濃度，分析提取溫度對脈紅螺多糖得率的影響。</p><p>　　3.4.3 提取時間</p><p>　　稱取脈紅螺干粉五分各1g，按料液比(W/V)1:80，在70℃下分別水浴15min、30min、60min、90min、120min，然后置于高速離心機3000r/min，離心10min，取上清液。按苯酚硫酸法測定脈紅螺多糖的濃度，分析提取時間對脈

36、紅螺多糖得率的影響。</p><p>　　3.5 脈紅螺多糖提取工藝的優(yōu)化</p><p>　　通過單因素試驗分析脈紅螺多糖的最佳提取條件，在各個因素最佳值附近選取3個水平，依據(jù)L9(33)正交試驗表進行設計，做三因素三水平正交實驗，以確定福壽螺多糖提取的最優(yōu)工藝。采用直觀分析方法，根據(jù)極差大小和方差分析確定影響提取因素的主次順序。</p><p><b>

37、;　　3.6 回收率實驗</b></p><p>　　精確稱取5份1g脈紅螺干粉，按料液比(W/V)1:100，在50℃下水浴1小時，離心取上清液，分別取1ml蒸煮液定容到100ml。從中各取lml定容后的蒸煮液于試管中，再分別1ml加入濃度為10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml的葡萄糖溶液，按照苯酚-硫酸法，比照標準曲線求的其濃度，再計算回收率。</p

38、><p>　　回收率（%）=(測定的多糖含量值—樣品多糖含量)/葡萄糖加入量x100%[22]</p><p><b>　　3.7重現(xiàn)性試驗</b></p><p>　　取一組式樣按多糖的測定方法操作，每隔15分鐘測定一次吸光度，測定2h。</p><p><b>　　4結果與討論</b></p&

39、gt;<p>　　4.1 葡萄糖標準曲線的繪制</p><p>　　用苯酚一硫酸法顯色，測定葡萄糖各濃度的吸光度，以吸光度為縱坐標，葡</p><p>　　萄糖濃度為縱坐標，繪制標準曲線，如圖1，曲線回歸方程：y=0.0594x +0.0227</p><p><b>　　R2=0.997。</b></p><

40、p>　　圖1標準曲線及回歸方程</p><p>　　Fig.1 Standard curve and regression equation</p><p>　　4.2 脈紅螺光譜掃描最大吸收峰選擇</p><p>　　經過苯酚-硫酸法處理后的脈紅螺 在400-600進行光譜掃描，由下圖2可知脈紅螺吸收峰在490nm處有最大值，故選擇490nm處定量測定。&l

41、t;/p><p>　　圖2脈紅螺400-600波譜圖</p><p>　　Wavespectrogram of Rapana venosa Valenciennes </p><p>　　4.3 脈紅螺去色素與為去色素的對比</p><p>　　由下圖3可知脈紅螺經過活性炭處理和未處理，對脈紅螺波譜圖形狀并沒有太大改變。證明色素對脈紅螺的含量測定

42、沒有明顯影響。</p><p>　　圖3脈紅螺去色與未去色對比圖譜</p><p>　　4.4.1 料液比對多糖提取量的影響</p><p>　　圖4料液比對多糖提取量的影響</p><p>　　Fig4 Effect of time on extraction volume</p><p>　　由圖4可知，脈紅螺多糖

43、的提取量隨著料液比的增大而相應的有一個遞增的過程。但通過觀察曲線，到后期增幅有所下降?？紤]到增大料液比給實驗操作，如離心帶來的不便，我們選定1:80為最佳料液比。</p><p>　　4.4.2提取溫度對多糖提取量的影響</p><p>　　圖5提取溫度對多糖提取量的影響</p><p>　　Fig 5 Effect of temperature on extra

44、ction volume</p><p>　　由圖5可知，提取溫度對買紅螺多糖的提取量有比較明顯的影響，脈紅螺的含量隨著溫度的升高有一定的上升，但是當?shù)竭_60℃后又有下降的趨勢，這可能和溫度升高，多糖發(fā)生氧化降解有關，出于得率和節(jié)能的考慮，我們選擇60℃為最佳的溫度。</p><p>　　4.4.3提取時間對多糖提取量的影響</p><p>　　圖6提取時間對多糖提

45、取量的影響</p><p>　　Fig 6 Effect of time on extraction volume</p><p>　　由圖6可知，提取時間對脈紅螺多糖的提取量有比較明顯的影響，多糖量先增后減，在30min到60min段有最大得率，70min后有比較明顯的下降，這可能是由于長時間的蒸煮，多糖已經完全的溶出來，延長時間不會明顯的增加多糖的含量，反而可能引入雜質，導致多糖總量

46、的下降?？紤]節(jié)約時間和能源，我們選擇60min為最佳提取時間。</p><p><b>　　4.5正交試驗結果</b></p><p>　　通過單因素試驗后，我們分別選取時間、溫度、料液比中的三個因素進行正交試驗。確定因素水平表見表1，正交試驗表1</p><p>　　表1正交試驗的因素及水平</p><p>　　Tab

47、 1 Factors and levels of the orthogonal experiment</p><p><b>　　表2正交試驗</b></p><p>　　Tab 2 orthogonal experiment</p><p>　　通過觀察表2可知各因素影響脈紅螺多糖提取量的排序為:料液比>提取溫度>提取時<

48、/p><p>　　間。最佳條件是在提取溫度60℃、料液比1：80、提取時間 1h。</p><p>　　4.6 穩(wěn)定性試驗</p><p>　　用苯酚-硫酸法測定脈紅螺多糖時，吸光度值隨時間的變化如下表3所示。結果顯示，在2h內產物的穩(wěn)定性良好。</p><p>　　表3脈紅螺多糖的穩(wěn)定性</p><p>　　Tab 3

49、 Recovery rate of Rapana venosa Valenciennes</p><p>　　4.7 加標回收率試驗</p><p>　　取多糖樣品5份，加入濃度不同的標準葡萄糖溶液，進行回收率實驗，結果如表４所示，回收率在82.11％～109.97％之間。</p><p>　　表4 脈紅螺加標回收試驗</p><p>　　T

50、ab 4 Callback ratio of Rapana venosa</p><p><b>　　5.結論</b></p><p>　　新鮮脈紅螺制成干粉得率為23.14%。苯酚硫酸法測定脈紅螺多糖含量方法簡單有效，穩(wěn)定性好。通過單因素試驗和正交優(yōu)化，可知各因素影響脈紅螺多糖提取量的排序為:料液比>提取溫度>提取時間。脈紅螺的最佳提取條件為提取溫度50

51、℃、料液比1：80、提取時間 1h。，脈紅螺干粉糖含量約為20.5%，樣品回收率在82.11％～109.97％之間。</p><p><b>　　參考文獻</b></p><p>　　[1]魏利平,邱盛堯.脈紅螺繁殖生物學的研究[J].水產學報，1999,6:151.</p><p>　　[2]張坤,王令充,吳皓，等.活性海洋多糖的功能及結構研

52、究概況[J].中國海洋藥物雜志，2010,6:55.</p><p>　　[3]Iciiinose K, Yamamoto M, Khoji T,et al.Antitumor effectof polysaccharide coated liposomal adriamycin on AH66 hepatomain nude mice [J].Anticancer Research,1998,18:401.&l

53、t;/p><p>　　[4]Volk R B, Venzke K, Blaschek W,et al. Complement modulating and anticoagulant effects of a sulfated exopolysaccharide released by the cyanobacteriumSynechocystis aquatilis[J].Planta Med,2006,72:14

54、24.</p><p>　　[5]文松松，趙峽，于廣利，等.海洋動物多糖研究進展[J].中國海洋藥物雜志，2009,8:47-51.</p><p>　　[6]Matou S, Colliee-Jouauh S, Galy-Fauroux I,et al. Effect of an oversulfated exopolysaccharide on angiogenesis induced

55、 by fibroblast growth factor-2 or vascular endothelial growth factor in vitro[J].Biochem Pharmacol,2005,69(5):751.</p><p>　　[7]江萍.食品多糖與機體免疫[J].食品工業(yè)科技,1997;(2):85.</p><p>　　[8]楊明亮，黃曉蘭，等.海帶多糖的抗輻射作

56、用與脾細胞凋亡[J].武漢大學學報，2004,5:240-241.</p><p>　　[9]唐潔．植物多糖生物活性功能的研究進展[J].食品研究開發(fā)，2006：130–131．</p><p>　　[10]Girola M, Bernardi M D, Contos S,et al. Dose effect inlipid-lowering activity of a new dieta

57、ry intergrator(chitosan,garcinia cambogia extract and chrome)[J].ActaToxico1Ther,1996， 17(1):25.</p><p>　　[11]汪東風.茶多糖的組分及理化性質[J].茶葉科學,1996,16(1):1-8.</p><p>　　[12]崔悅禮，李開源，呂琦，等.河片多糖(Mpa)對巨噬細胞吞噬能力

58、的影響與抗炎作用[J].云南大學學報(自然科學版)，1995，20(03)：155-156.</p><p>　　[13]余宗陽，王文武，等.香茹多糖的抗炎作用[J].福州總醫(yī)院學報，2006,9:172-173.</p><p>　　[14]劉訓紅，鬧毓銘，王玉璽，等.太子參多糖的研究[J].中草藥，1993，24(3):119.</p><p>　　[15]馬淑

59、淘，張?zhí)烀?，劉立，?硫酸軟骨素生產工藝探討[J].中國藥學雜志，1993，28(12):741.</p><p>　　[16]沈渤江，張?zhí)烀?，吳柯，?不同工藝制備的硫酸軟骨素的理化性質差異[J].中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，1990,21(5):208.</p><p>　　[17]張惟杰.糖復合物生化研究技術(第二版)[M].浙江:浙江大學出版社，1999.196,245.</p>

60、<p>　　[18]張萍，劉胖，吳月國，等.酶法提取石解多糖的研究[J].浙江省醫(yī)學科學院學報，2005，12(63):323.</p><p>　　[19]劉青梅，楊性民，鄧宏霞，等.采用微波技術提取紫菜多糖的工藝研究[J].農業(yè)工程學報，2005,21(2):153-156.</p><p>　　[20]陳玉懷，趙文斌.天山大黃多糖的超聲提取及含量測定[J].李時珍國醫(yī)國

61、藥，2006,17（2）；223-224.</p><p>　　[21]羅毅，劉剛，等.苯酚-硫酸法測定多糖含量顯色方式的優(yōu)選[J].中國中醫(yī)藥信息雜志,2005:45-46.</p><p>　　[22]許桂芹.福壽螺多糖的分離純化及其生物活性研究[D].福建農林大學，2008,4：15-16.</p><p>　　海帶中硫酸多糖的抗氧化性的研究進展</p&

62、gt;<p>　　趙雪& 薛長汻& 李魃放</p><p>　　[摘要]合成物，分子量，與試管內多種硫酸多糖的抗氧化性進行比較分析。硫酸多糖是通過對海帶進行離子交換色譜，加酸水解，降解天然的硫酸多糖來獲取的。低硫酸化的F-A2的最高分子量在5到15kDa之間，其中硫酸酯占14.5%，葡萄糖醛酸占21.8%。它在抗超氧化物和羥基自由基上表現(xiàn)出強氧化性，甚至比部分分子量大的F-A和F-B

63、的活性還高。然而，在達到最大分子量15kDa時，高硫酸化的部分比其他部分的抗氧化性低。這些結果表明低分子量的硫酸根基團對有氧自由基的反應呈現(xiàn)出物理塊。在化學特性和抗氧化性上，通過對天然的硫酸多糖進行降解獲得的硫酸多糖部分和加酸水解得到的硫酸多糖部分完全不同。通過徹底的降解，高分子量分子分解成LM2和LM1，其中LM2最高分子量為8kDa,LM1最高分子量為1.5kDa,產量分別為40%和15%。LM2的海藻糖和硫酸酯含量比較多，但葡萄糖

64、醛酸的含量比較少?？寡趸员砻鱈M2不能去除超氧化物和羥基自由基。這就表明了徹底降解主要針對含有大量葡萄糖醛酸的生物，而對含有豐富硫酸化海藻糖的生物不起作用。然而，最高分子為1.5kDa的LM1仍保留對超氧化自由基的去除能力，盡管這不包括</p><p>　　[關鍵詞]海帶，硫酸多糖，自由基，抗氧化性，徹底降解過程。</p><p><b>　　簡介 </b>&l

65、t;/p><p>　　總所周知，含有硫酸多糖的褐藻含有L海藻糖和硫酸酯。它們的構成跟季節(jié)，種群年齡，物種地理位置有很大的關系。在過去的十年中，很多研究已經證明了褐藻中的硫酸多糖具有好的生物特性，包括抗凝性，抗炎，抗癌性。（佩雷拉 1994；西野村等 1989；奧瑪特等 1997；張等1995）關于生物活性和結構的關系研究顯示生物的抗凝性和抗癌性必須具備幾種結構參數(shù)，例如分子量，硫酸度，硫酸化位置，糖的種類以及糖苷分支

66、。（巴普納等 1993；佩雷拉等 2002）此外，褐藻糖膠在對動物病毒導致的污染這一潛在風險的減少上有優(yōu)勢。作為碘和藻鹽酸物的副產品，從海帶中提取的硫酸多糖中豐富的海洋化合物在醫(yī)學領域有潛在的應用前景。</p><p>　　近年來，有關紫菜中的硫酸多糖（張等 2003），石莼中的硫酸多糖（齊等 2005）黑角藻中的硫酸多糖（魯佩雷斯等 2002）海帶中的硫酸多糖（薛等2000）褐藻門昆布中的硫酸多糖（胡等 200

67、1）的研究已經證明了硫酸多糖的抗氧化性。但是到目前為止，很少有報道是關于結構與藻類硫酸多糖的抗氧化性之間的聯(lián)系。特斯帕里等（2001）研究了關于自由基是否能分解葡聚糖和非葡聚糖聚合物，他們發(fā)現(xiàn)聚合電解質，例如硫酸葡聚糖和磷酸鹽能夠增強它們的分解能力。齊（2005）發(fā)現(xiàn)孔石莼中的低硫酸鹽低分子量的多糖物質有強的消色力和所含的自由基比其他的硫酸多糖分解效果更好。劉等人（1997）發(fā)現(xiàn)多糖分子中蛋白質物質的存在增強了它們自由基的分解能力?？墒?/p>

68、，其他的結構因素，例如硫酸鹽化程度，硫酸化的位置，糖的種類，糖苷的分支等，對抗氧化性的作用以及硫酸多糖的抗氧化性的作用機理仍未查清。</p><p>　　在本文的研究中，我們嘗試探究不同硫酸多糖的化學特性與在含氧自由基上的抗氧化性之間的關系，并進一步探索硫酸多糖的抗氧化性的作用機理。為了達到這個目的，我們通過陰離子交換層析，加酸水解，徹底降解的方法從海帶中的天然硫酸多糖中提取了多種硫酸多糖物質。通過用超氧化物和自

69、由羥基的化學發(fā)光來檢測試管內硫酸多糖的抗氧化性。</p><p><b>　　材料和方法</b></p><p>　　海帶中的黑藻采集于2005年5月的中國山東榮成并儲藏在零下四度的地方。發(fā)光氨(5-amino-1, 2, 3, 4-tetrahydrophthalazin-1, 4-dion)買自德國達姆斯塔特的默克公司。肌肽來自Wako Pure Chemistr

70、ies。</p><p>　　山茶中天然藻類含硫酸多糖是根據(jù)西野村等人的研究（1989）并通過Q瓊脂糖FF類（來自新澤西皮斯卡塔維的電泳儀生物技術）的陰離子層析法獲取的。低硫酸化F-A是通過濃度為1.0摩爾每升的氯化鈉溶析獲取的，而高硫酸化F-B是通過濃度為2.0摩爾每升的氯化鈉獲取的。</p><p>　　F-A和F-B各3克，并分別溶解在100毫升濃度為80毫摩爾的硫酸溶液中，并在80

71、攝氏度的條件下電解9小時。低分子量的F-A部分（小于5kDa）,F-A2(5-15kDa)，F(xiàn)-B（小于5kDa）以及F-B2（5-15kDa）通過5kDa和15kDa的細胞膜截留獲取的。（上海應用物理研究所，中國科學院）。F-A, F-B的分子量和化學特性以及酸水解性見表1。</p><p>　　褐藻的原子團降解過程從銅過氧化物還原系統(tǒng)中合成自由羥基。1g天然的褐藻糖膠與0.4毫摩爾醋酸銅水合物在PH為7.5時

72、混合，在60攝氏度的溫度反應器中分解5小時。在分解過程中以每小時12毫升的速度添加過氧化物（9%v/v）。低分子量的LM1部分（小于5kDa）和LM2（5-15kDa）通過5kDa和15kDa的細胞膜輪流截留的超濾方法獲取。LM1和LM2的分子量和化學特性見表2。</p><p>　　F-A和F-B褐藻膠糖分子量是由高性能的空間排阻色譜分析法決定的。這種方法是在濃度為0.2摩爾每升的氯化鈉中用由日本東曹生產的TS

73、K-gel G4000Pwxl，并用G1362ARID作為檢測器。FA1, F-A2, F-B1, F-B2, LM1 and LM2 的分子量也是由高性能的空間排阻色譜分析法決定的。但不同的是，這次試驗運用的日本東曹生產的TSK-gel G3000Pwxl。這兩個種類通過藍色葡聚糖，分子量為5kDa, 8kDa,10kDa的葡聚糖硫酸酯以及海藻糖（164.16Da）的不同而區(qū)分。（西格瑪, 圣路易斯 MO）分子量的最大值，平均分子量，

74、數(shù)量平均分子量和多分散性由安捷倫的化學工作站決定的。</p><p>　　糖醛酸含量由改進了的比特和穆爾的咔唑方法決定的，該方法運用葡萄糖酸作為標準值。中性糖成分是由氣液色譜法獲取的。這種方法就是用20毫克的樣品放置在溫度為100攝氏度濃度為2摩爾每升的三氟二酸中水解6小時。硫酸鹽的含量是道奇森和普拉斯的方法推斷得出的。褐藻糖膠在強氧化物和自由羥基上的分解效果是分別通過化學發(fā)光分析法檢測的。這種方法由焦棓酸-發(fā)光

75、氨系統(tǒng)和抗壞血酸的超氧化銅酵母懸架系統(tǒng)組成的 。一個化學發(fā)光檢測器（中國瑞利WDD-2）被用于超強氧化物和自由羥基的檢測上。在添加了硫酸多糖后，記錄下自由基的開始和最終的化學發(fā)光數(shù)據(jù)。自由基上的分解速率等于開始量減去最終量再除以開始量的百分數(shù)。IC50是在自由基上分解速率為50%的硫酸多糖的含量。</p><p><b>　　試驗結果</b></p><p>　　排阻

76、色譜法的實驗結果證明了F-A的最大分子量能夠達到742kDa，比F-B（175.9kDa）的高很多。F-B的化學特性顯示其海藻糖（49.0%）和硫酸酯（33.5%）的含量高于F-A的含量，然而葡萄糖醛酸在F-B的含量卻不到F-A含量的一半。F-A和F-B的酸水解性通過超濾法來區(qū)分，這種方法是依據(jù)分子量的大?。?5kDa和5kDa）。每組化學性質見表1。低分子量的部分主要包括分子量在5-15kDa以及在5kDa之下的部分。它們與根源部分具

77、有相似的葡萄糖醛酸含量，但是由于水解過程的脫硫作用，硫酸酯的含量低于根源部分。</p><p>　　F-A和F-B的分解效果和他們在超氧化自由基和羥基自由基上的酸水解性用肌肽作為正控制。作為含有高分子量的天然多糖，盡管F-B的硫酸酯含量高于F-A中的含量，F(xiàn)-A和F-B在超氧化自由基上具有相似的分解效果。F-A經過水解之后，低分子量F-A2部分（最高值為5-15kDa）在超氧化自由基上比F-A或者肌肽具有更強的分

78、解能力。with IC50 = 0.26 mg ml?1, 然而F-A1（最高值為5kDa）在超氧化自由基上效果不如F-A2，在濃度為0.75毫克每毫升的溶液中速率為40.6%。與此相反，高硫酸化的F-B1和F-B2在超氧化自由基上表現(xiàn)出的效果不如天然的F-B。在濃度為0.75毫克每毫升的溶液中，F(xiàn)B1和FB2的抑制速率分別只有28.8%和40.6%。 以分子量不同來區(qū)分的F-A1和F-A2在超氧化自由基上比高硫酸化的F-B1和F-B2

79、的分解能力更強。</p><p>　　數(shù)據(jù)3和數(shù)據(jù)4表明F-A和F-B的羥基自由基和它們的酸水解表現(xiàn)出分解效果。F-A的羥基自由基在IC50=0.60和0.85毫克每毫升時都比F-B具有更高的分解能力，但是F-A和F-B都抑制了羥基自由基的化學發(fā)光，以至于比肌肽還低。在F-A和F-A2（最高分子量為5-15kDa）酸水解之后，它們比原有的F-A更具有強抗氧化性。（IC50=0.3mg ml-1）相反，F(xiàn)-B的水解

80、減弱了它們的分解能力。F-B1和F-B2在羥基自由基上分解效果很差。</p><p>　　硫酸多糖的徹底分解過程</p><p>　　徹底分解過程開始于氫的還原系統(tǒng)中羥基自由基的合成過程。在酸堿度適中的情況下，這些物種對主要多糖有反應性和分解性。5個小時后，高分子量的降解為LM2（最高值為8kDa）和ML1（最高值為1.5kDa）,產量分別為40%和15%。排阻色譜法的結果證明了LM1和L

81、M2比原有的部分相比分子量分布較狹窄，分散性分別是1.1和1.2。然而LM1和LM2的主要組成與剛開始的化合物完全不同。LM1和LM2的化學特性見表2。值得注意的是，LM2部分（最高值為8kDa）有豐富的硫酸酯（36.5%）和海藻糖（57.8%），在很大程度上比F-B的還高。相反，LM1（最高值為1.5kDa）硫酸酯只有23.4%，葡萄糖醛酸為2%。中性糖的構成表明了LM1半乳糖，甘露糖，海藻糖含量不多。</p><

82、p>　　數(shù)據(jù)5顯示了LM1和LM2在超氧化自由基上的分解效果。超氧化自由基的化學發(fā)光證明了高硫酸化的LM2（海藻糖為57.8%）對超氧化自由基沒有分解效果。與此相反，最高值為1.5kDa的LM1部分保留了與原有多糖類似的分解能力。值得一提的是多糖的羥基自由基的分解作用使其失去了對羥基自由基的抗氧化性。在任何濃度條件下，LM1和LM2沒有抗氧化性。</p><p><b>　　討論</b>

83、;</p><p>　　兩種高分子量的海藻糖膠是通過陰離子交換法獲取的，硫酸酯的含量分別為16.5%和33.5%。這兩種含有復雜的硫酸多糖，這些多糖里包含了不同數(shù)量的葡萄糖醛酸，海藻糖，半乳糖，甘露糖和葡萄糖。然而，它們砸開超氧化自由基和羥基自由基上的分解能力差不多。這些化合物的異質性和高分子量使它們的作用機理研究變得困難。正因為如此，我們準備了有特點的低分子量部分，并從中獲取了一些對分析其抗氧化性有作用的信息。

84、</p><p>　　在氧化自由基上，褐藻糖膠的抗氧化能力的不同可能是由于它們不同的分子量和化學成分不同引起的。作為葡萄酯，高分子量的F-B和F-A表現(xiàn)完全不同，但是它們在羥基自由基和超氧化自由基上表現(xiàn)出相似的分解能力。酸水解物F-A1, F-A2, F-B1和F-B2與它們的原有F-A和F-B化學成分相似。我們研究發(fā)現(xiàn)硫酸酯含量為14.5%和葡萄糖醛酸含量為21.8%的低分子量F-A2在超氧化自由基和羥基自由基

85、比原有的F-A和F-B抗氧化性更強。然而，分子量相似的高硫酸化F-B1和F-B2在超氧化自由基和羥基自由基比低硫酸化部分分解能力相對較弱。這些結果表明硫酸酯的含量在氧化自由基上的分解能力對低分子量海藻糖膠比高分子海藻糖膠發(fā)揮的作用更大。以此推斷出F-B1和F-B2硫酸聚合物對氧化自由基表現(xiàn)出物理塊。海藻糖膠的抗氧化性是由化學成分決定的，尤其是由分子量，硫酸酯，葡萄糖醛酸決定的。然而，這些化合物的作用機理，也就是指它們的抗氧化性，仍然沒有

86、弄清楚。進一步探究的是關于來源于徹底分解過程中產物的化學特性和抗氧化性。</p><p>　　兩種低分子量褐藻糖膠部分是由天然的多糖經過徹底分解得到的。這種方法具有高產出和好再現(xiàn)性。化學分析表明分解得到的低分子量部分與那些經過酸分解得到的部分其化學性質不同。LM2（最高值為8kDa）含有豐富的海藻糖和硫酸酯，但是葡糖糖醛酸的含量不多。這個結果與納爾代拉等（1996）和舍沃洛等（1999）的研究結果相一致。納爾代拉

87、報道稱褐藻糖膠在醋酸纖維素膜上電泳結果顯示徹底分解過程主要是富含有葡萄糖醛酸的生物，然而部分富含硫酸化L海藻糖的保持不變。 </p><p>　　在我們的實驗中，低分子量高硫酸化部分在超氧化自由基和羥基自由基上的分解效果不好。尤其是，通過徹底分解得到的LM2部分幾乎完全沒有分解。這個結果進一步證明了富含硫酸化的L海藻糖部分很難被含氧自由基分解，也沒有能力分解含氧自由基。不過，含有少量葡萄糖醛酸的LM1仍然對超氧化

88、自由基具有分解能力。中性糖化合物顯示這是一種硫酸化低聚糖，主要含有半乳糖和甘露糖。這些結果表明了富含有葡萄糖醛酸的部分和富含半乳糖和甘露糖是對含氧自由基具有抗氧化性的原因。氧自由基跟這些部分在一起反應更簡單，裂開糖苷鍵和氧化葡萄糖醛酸。結果就是氧自由基被分解而減少。</p><p>　　由于多糖分子太大而不能作為一種藥物，低分子量海藻糖部分是通過加酸水解和自由基斷裂得到的。這種低分子量多糖，其中一些還保持抗氧化性