血卵渦鞭蟲感染對(duì)三疣梭子蟹非特異性免疫指標(biāo)的影響【畢業(yè)論文】

1、<p>　　本科畢業(yè)論文(設(shè)計(jì))</p><p>　題 目：血卵渦鞭蟲感染對(duì)三疣梭子蟹非特異性免疫指標(biāo)的影響</p><p>　學(xué) 院：</p><p>　學(xué)生姓名：</p><p>　專 業(yè)：水產(chǎn)養(yǎng)殖</p><p>　班 級(jí)：</p><p>　指導(dǎo)教師：&

2、lt;/p><p>　起止日期：</p><p><b>　　目錄</b></p><p><b>　　中文摘要1</b></p><p><b>　　英文摘要2</b></p><p><b>　　1. 前言4</b></

3、p><p>　　1.1 三疣梭子蟹的養(yǎng)殖狀況4</p><p>　　1.2 三疣梭子蟹養(yǎng)殖出現(xiàn)的問(wèn)題4</p><p>　　1.3 血卵渦鞭蟲的感染狀況4</p><p>　　1.4 甲殼動(dòng)物免疫防御機(jī)制4</p><p><b>　　材料與方法5</b></p><p&

4、gt;　　2.1 試驗(yàn)材料5</p><p>　　2.2 試驗(yàn)方法5</p><p><b>　　3. 試驗(yàn)結(jié)果6</b></p><p>　　3.1 血卵渦鞭蟲感染三疣梭子蟹及健康梭子蟹非特異性免疫指標(biāo)對(duì)比7</p><p>　　3.2 注射臺(tái)盼藍(lán)染色血卵渦鞭蟲蟲體對(duì)梭子蟹血淋巴的影響8</p>

5、<p><b>　　4. 結(jié)論10</b></p><p><b>　　致謝11</b></p><p><b>　　參考文獻(xiàn)12</b></p><p>　　血卵渦鞭蟲感染對(duì)三疣梭子蟹非特異性免疫指標(biāo)的影響</p><p>　　[摘要] 試驗(yàn)用血卵渦鞭蟲感染

6、梭子蟹樣本均于2011年8月采集于舟山市朱家尖某梭子蟹養(yǎng)殖塘（見(jiàn)圖1），采集疑似雄性感染樣本共48只（22.3±3.8g）；健康蟹采集于臨近養(yǎng)殖塘，共采集雄性樣本20只（24.6±4.3g）。疑似感染樣本及健康蟹均采用顯微鏡檢及PCR診斷篩選，分組后采樣分析；試驗(yàn)用注射感染樣本捕撈于浙江省海洋水產(chǎn)研究所西軒島試驗(yàn)場(chǎng)梭子蟹養(yǎng)殖塘，雄性30只(121g±16g)，平均分為6組，以充氧機(jī)充氣暫養(yǎng)于100L的塑料桶

7、中。經(jīng)顯微初篩及PCR診斷確認(rèn)，從50個(gè)疑似樣本中選取10個(gè)嚴(yán)重感染樣本作為血卵渦鞭蟲感染組，從20個(gè)健康樣本中隨機(jī)選取10個(gè)樣本作為健康梭子蟹對(duì)照，兩組間體重差異不顯著。感染樣本與健康樣本表觀差異（圖2）：感染血卵渦鞭蟲的梭子蟹普遍活動(dòng)能力較弱，血淋巴顏色呈白濁狀，凝固能力較差，顯微鏡下可見(jiàn)大量的與梭子蟹血細(xì)胞大小類似的血卵渦鞭蟲，而健康梭子蟹則活力較強(qiáng)，血淋巴為稍帶藍(lán)色，血淋巴在體外一分鐘即可凝固。血卵渦鞭蟲感染三疣梭子蟹及健康梭子

8、蟹非特異性免疫指標(biāo)對(duì)比見(jiàn)表1由表1可見(jiàn)發(fā)現(xiàn)感染血卵渦鞭蟲后，梭子蟹血細(xì)胞大幅減少（圖3），有的樣本血細(xì)胞數(shù)幾乎不可檢出，</p><p>　　[關(guān)鍵字] 三疣梭子蟹 感染 血卵渦鞭蟲</p><p>　　Blood eggs vortex whipworm infection Portunus trituberculatus non-specific immune indicators

9、 </p><p>　　[Abstract] Test blood eggs vortex whipworm infection the Portunus samples Zhujiajian a swimming crab aquaculture ponds (see Figure 1) were collected in August 2011, collecting a total of 48 suspec

10、ted male infection samples (22.3 ± 3.8g); health crab collected near the breeding pond, were collected from 20 male samples (24.6 ± 4.3g). Suspected of being infected samples and healthy crab both microscopy an

11、d PCR diagnostic screening, packet sampling and analysis; test injection fishing samples of in</p><p>　　[Key words] Three trituberculatus; Infection; Blood eggs vortex whipworm</p><p>　　血卵渦鞭蟲感染

12、對(duì)三疣梭子蟹非特異性免疫指標(biāo)的影響</p><p><b>　　前言</b></p><p>　　1.1 三疣梭子蟹的養(yǎng)殖狀況</p><p>　　三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）隸屬甲殼綱、十足目、梭子蟹科、梭子蟹屬，屬大型海產(chǎn)經(jīng)濟(jì)蟹類，在我國(guó)北方遼東半島一直到南海海域均有分布，因其肉味鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富、深受消費(fèi)者

13、喜愛(ài)[1]。為浙江省名牌養(yǎng)殖海產(chǎn)品，具有較強(qiáng)區(qū)域優(yōu)勢(shì)，總養(yǎng)殖總面積占全國(guó)養(yǎng)殖養(yǎng)殖面積1/3，總產(chǎn)量的1/2，已形成梭子蟹養(yǎng)殖、加工、出口一條龍的規(guī)模性產(chǎn)業(yè)。</p><p>　　1.2 三疣梭子蟹養(yǎng)殖出現(xiàn)的問(wèn)題</p><p>　　隨著市場(chǎng)需求的日益提升，梭子蟹海水養(yǎng)殖規(guī)模發(fā)展迅猛，但由于梭子蟹配合飼料尚未解決，餌料投喂依然以張網(wǎng)捕撈低質(zhì)小雜魚及貝類為主，整個(gè)養(yǎng)殖過(guò)程需大排大灌以維持水質(zhì)，

14、因此養(yǎng)殖方式較為粗放，整體管理水平相對(duì)較低，不可避免的導(dǎo)致梭子蟹遭受各種病害的侵襲，目前報(bào)道的梭子蟹病原包括：血卵渦鞭蟲(Hematodinium sp.) [2]、纖毛蟲、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus) [4]、假絲酵母菌(Candida olephila) [5]、孢子蟲等，其中以血卵渦鞭蟲危害最為嚴(yán)重，流行發(fā)病期在每年6-11月份， 7-9月份高水溫期為發(fā)病高峰，會(huì)在短時(shí)間內(nèi)造成嚴(yán)重死亡，給我省養(yǎng)殖戶造成巨大

15、經(jīng)濟(jì)損失。</p><p>　　1.3 血卵渦鞭蟲的感染狀況</p><p>　　血卵渦鞭蟲是一種危害海水甲殼類動(dòng)物的寄生性原生動(dòng)物，已報(bào)道流行于：澳大利亞、阿拉斯加、蘇格蘭、加拿大以及美國(guó)東部阿拉斯加沿岸等地，感染宿主包括：挪威龍蝦(N. norvegicus)、蘭蟹(C. Sapidus)、白氏雪蟹 (C. bairdi)以及蛛雪蟹(C. opilo)等許多重要經(jīng)濟(jì)甲殼類的漁業(yè)生產(chǎn)[2

16、]。</p><p>　　1.4 甲殼動(dòng)物免疫防御機(jī)制</p><p>　　疾病的防御除了依賴各種藥物之外，更多的還需依靠養(yǎng)殖動(dòng)物自身免疫能力的提升。很多研究均證實(shí)雖然低等的甲殼類動(dòng)物尚不具備脊椎動(dòng)物的完整免疫系統(tǒng)，但當(dāng)其受到寄生蟲、細(xì)菌真菌等病原侵襲時(shí)，其自身非特異性免疫系統(tǒng)也會(huì)進(jìn)行積極的主動(dòng)防御[6]。趙青松等在三疣梭子蟹血淋巴中檢出6種免疫防御相關(guān)酶，包括酸、堿性磷酸酶(ACP、AK

17、P)、超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化物酶(POD)、酚氧化物酶(PO)和溶菌酶(LZM)等[7]，。宋曉玲等發(fā)現(xiàn)感染白斑病毒（WSSV）后的對(duì)蝦血淋巴細(xì)胞數(shù)量大幅下降,凝固能力差,說(shuō)明對(duì)蝦在應(yīng)對(duì)病毒感染時(shí)調(diào)動(dòng)了大量血細(xì)胞進(jìn)行了免疫防御[8]。</p><p>　　本文對(duì)感染血卵渦鞭蟲的三疣梭子蟹及健康梭子蟹血淋巴中非特異性免疫相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行了對(duì)比，并采用臺(tái)盼藍(lán)染色的血卵渦鞭蟲對(duì)三疣梭子蟹進(jìn)行注射后連續(xù)取樣觀察，探

18、究三疣梭子蟹對(duì)血卵渦鞭蟲顆粒的免疫清除機(jī)制，以期對(duì)三疣梭子蟹寄生蟲疾病的免疫相關(guān)防治技術(shù)提供理論參考。</p><p><b>　　2. 材料與方法</b></p><p><b>　　2.1 試驗(yàn)材料</b></p><p>　　試驗(yàn)用儀器：NIKON 80i顯微鏡，BIO-RAD PCR儀，722型分光光度計(jì)。<

19、/p><p>　　試驗(yàn)用血卵渦鞭蟲感染梭子蟹樣本均于2011年8月采集于舟山市朱家尖某梭子蟹養(yǎng)殖塘（見(jiàn)圖1），采集疑似雄性感染樣本共48只（22.3±3.8g）；健康蟹采集于臨近養(yǎng)殖塘，共采集雄性樣本20只（24.6±4.3g）。疑似感染樣本及健康蟹均采用顯微鏡檢及PCR診斷篩選，分組后采樣分析；試驗(yàn)用注射感染樣本捕撈于浙江省海洋水產(chǎn)研究所西軒島試驗(yàn)場(chǎng)梭子蟹養(yǎng)殖塘，雄性30只(121g±

20、16g)，平均分為6組，以充氧機(jī)充氣暫養(yǎng)于100L的塑料桶中。</p><p>　　圖1. 感染血卵渦鞭蟲的梭子蟹養(yǎng)殖塘</p><p>　　注射用血卵渦鞭蟲采集于感染血卵渦鞭蟲瀕臨死亡梭子蟹樣本，從游泳足基膜處采用無(wú)菌注射器抽取病蟹血淋巴，0.5%福爾馬林固定24小時(shí)后，經(jīng)5次低速離心（1000r/min）無(wú)菌海水洗滌后備用。</p><p>　　各種免疫酶檢測(cè)試

21、劑盒均購(gòu)買自南京建成生物工程研究所。</p><p><b>　　2.2 試驗(yàn)方法</b></p><p>　　2.2.1 血卵渦鞭蟲感染梭子蟹與健康梭子蟹非特異性免疫指標(biāo)的檢測(cè)</p><p>　　血淋巴及肝胰腺樣品采集 對(duì)采集的48只疑似感染梭子蟹樣本及20只健康梭子蟹先用</p><p>　　潔凈毛巾擦干體表水分

22、，然后用酒精棉球擦拭其游泳足基膜部位，用已抽取0.5mL福爾馬林（濃度0.5%）的1mL無(wú)菌注射器抽取血淋巴0.5mL用于血卵渦鞭蟲感染初篩及血細(xì)胞計(jì)數(shù)；抽取血淋巴0.2ml用于血卵渦鞭蟲的PCR診斷；另外盡可能多的采集血淋巴，裝入離心管，37℃靜置2小時(shí)，4℃過(guò)夜，6000r/min 4℃離心采集上清，分裝后保存于-70℃用于非特異性免疫指標(biāo)的測(cè)量。以無(wú)菌剪刀取一小塊梭子蟹肝胰腺組織放入離心管凍存于-70℃用于肝胰腺抗氧化能力的檢測(cè)。

23、</p><p>　　血卵渦鞭蟲診斷與分組 采用NIKON 80i顯微鏡對(duì)樣本血淋巴進(jìn)行初篩，并采用針對(duì)</p><p>　　血卵渦鞭蟲ITS1基因特異性引物Primer 1：5’-CTGATTACGTCCCTGCCCTT-3’；Primer 2：5’-GCATGTCGCTGCGTTCTTC-3’進(jìn)行PCR擴(kuò)增，進(jìn)行更為準(zhǔn)確的血卵渦鞭蟲診斷。</p><p>　　

24、擴(kuò)增程序：PCR反應(yīng)體系（25μL）為：2.5μL10×buffer、2μL dNTP（2.5mM）、Primer 1和Primer 2 (25μM)各0.25μL、Taq DNA聚合酶0.2μL、模板0.5μL，用滅菌去離子水補(bǔ)充反應(yīng)總體積至25μL，將混合物置PCR儀中反應(yīng)。PCR循環(huán)參數(shù)：94℃ 預(yù)變性5min后開(kāi)始循環(huán)，94℃ 45s、55℃ 45s，72℃ 1min，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸7min。5μL PC

25、R產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，在紫外凝膠成像儀中照相記錄,以出現(xiàn)585bp左右條帶為血卵渦鞭蟲陽(yáng)性樣本（參見(jiàn)參考文獻(xiàn)7）。</p><p>　　選取感染嚴(yán)重的10個(gè)樣本及10個(gè)健康樣本用于非特異性免疫指標(biāo)的分析比較。</p><p>　　非特異性免疫指標(biāo)測(cè)定方法 對(duì)上述感染血卵渦鞭蟲梭子蟹及健康梭子蟹樣本進(jìn)行如下非特異性免疫指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)：包括：血淋巴血細(xì)胞總數(shù)、超氧化物歧化酶（SOD）、酸性

26、磷酸酶ACP活性、一氧化氮（NO）含量和肝胰腺總抗氧化能力（T-AOC）等。</p><p>　　其中血細(xì)胞計(jì)數(shù)采用25×16規(guī)格的血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，每個(gè)樣本計(jì)數(shù)3次取平均值。</p><p>　　SOD采用方法:通過(guò)黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶系統(tǒng)反應(yīng)產(chǎn)生超氧陰離子自由基（O2-），后者能氧化羥胺形成亞硝酸鹽，與顯色劑作用能呈現(xiàn)紫紅色，測(cè)定樣品中的SOD對(duì)超氧陰離子自由基有專一性的抑制作

27、用，能亞硝酸鹽的形成減少，通過(guò)分光光度計(jì)比色測(cè)定樣品管與對(duì)照管的吸光值(DO)，經(jīng)以下公式： </p><p>　　SOD活力(U/mL)=(DO對(duì)照管 –DO測(cè)定管)/DO對(duì)照管÷50%×反應(yīng)體系稀釋倍數(shù)×樣本稀釋倍數(shù)</p><p>　　計(jì)算即可得出樣品SOD的濃度。 ： </p><p>　　ACP活性采

28、用磷酸苯二鈉法，以100mL血清在37℃與底物作用60min，產(chǎn)生1mg酚為1個(gè)酶活力單位，活性計(jì)算公式：</p><p>　　酸性磷酸酶（U/100mL）= DO測(cè)定管/DO標(biāo)準(zhǔn)管×標(biāo)準(zhǔn)管含酚量×100ml/0.05ml</p><p>　　NO含量的測(cè)定則是利用NO性質(zhì)活潑（可迅速代謝轉(zhuǎn)為NO2-和NO3-）的特性，用硝酸還原酶特異性將NO3-還原為NO2-，再通過(guò)

29、采用硝酸鹽顯色劑生成紅色偶氮化合物來(lái)間接測(cè)定，通過(guò)分光光度計(jì)吸光值測(cè)定來(lái)進(jìn)行NO的定量分析。</p><p>　　肝胰腺中抗氧化能力測(cè)定原理是利用肝胰腺中抗氧化物質(zhì)可將Fe3+還原為Fe2+，而Fe2+可與菲啉類物質(zhì)形成穩(wěn)定的絡(luò)合物，通過(guò)比色可測(cè)定出抗氧化能力的高低。</p><p>　　以上各指標(biāo)均采用生產(chǎn)自同一批次的南京建成生物工程有限公司的檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)樣品每個(gè)指標(biāo)測(cè)定2次

30、取平均值。</p><p>　　2.2.2 注射臺(tái)盼藍(lán)染色血卵渦鞭蟲蟲體對(duì)梭子蟹血淋巴的影響</p><p>　　血卵渦鞭蟲的臺(tái)盼藍(lán)染色：將1.1中準(zhǔn)備好的血卵渦鞭蟲用1.2%臺(tái)盼藍(lán)染色10min，再以滅菌海水洗滌離心5次，靜置過(guò)夜后，再以滅菌海水離心洗滌2次，稀釋后備用，經(jīng)血球計(jì)數(shù)板板計(jì)數(shù)定量，濃度為2.2×106cells/mL。</p><p>　　

31、用酒精擦拭三疣梭子蟹游泳足基膜處，以1mL一次性注射劑吸取已確定濃度的血卵渦鞭蟲懸濁液，從基膜處注射0.1mL蟲體懸濁液。其中10只梭子蟹注射滅菌海水作為對(duì)照</p><p>　　注射后5min、30min、1h、48h、45d各取樣2只解剖觀察藍(lán)色蟲體顆粒處的位置，顯微鏡觀察血淋巴中血細(xì)胞變化及鰓等組織的變化。</p><p>　　2.2.3 數(shù)據(jù)處理 </p><p

32、>　　所有測(cè)定數(shù)據(jù)經(jīng)EXCEL數(shù)據(jù)分析得出平均值與標(biāo)準(zhǔn)差，用SPSS 11.5進(jìn)行單因素方差分析，p<0.05表示差異顯著，p<0.01表示差異極顯著。</p><p><b>　　3. 試驗(yàn)結(jié)果</b></p><p>　　3.1 血卵渦鞭蟲感染三疣梭子蟹及健康梭子蟹非特異性免疫指標(biāo)對(duì)比</p><p>　　經(jīng)顯微初篩及PC

33、R診斷確認(rèn)，從50個(gè)疑似樣本中選取10個(gè)嚴(yán)重感染樣本作為血卵渦鞭蟲感染組，從20個(gè)健康樣本中隨機(jī)選取10個(gè)樣本作為健康梭子蟹對(duì)照，兩組間體重差異不顯著。</p><p>　　感染樣本與健康樣本表觀差異（圖2）：感染血卵渦鞭蟲的梭子蟹普遍活動(dòng)能力較弱，血淋巴顏色呈白濁狀，凝固能力較差，顯微鏡下可見(jiàn)大量的與梭子蟹血細(xì)胞大小類似的血卵渦鞭蟲，而健康梭子蟹則活力較強(qiáng)，血淋巴為稍帶藍(lán)色，血淋巴在體外一分鐘即可凝固。<

34、/p><p>　　血卵渦鞭蟲感染三疣梭子蟹及健康梭子蟹非特異性免疫指標(biāo)對(duì)比見(jiàn)表1由表1可見(jiàn)發(fā)現(xiàn)感染血卵渦鞭蟲后，梭子蟹血細(xì)胞大幅減少（圖3），有的樣本血細(xì)胞數(shù)幾乎不可檢出，而健康梭子蟹血細(xì)胞數(shù)在（27632±4541）×103cells/mL，差異極顯著（P<0.01）。</p><p>　　圖2 嚴(yán)重感染血卵渦鞭蟲的三疣梭子蟹，可見(jiàn)血淋巴變不正常的白濁色</p

35、><p>　　Fig1 Heavily Hematodinium sp. infected Portunus trituberculatu，shows the milky-like haemolymph</p><p>　　圖3 感染血卵渦鞭蟲后梭子蟹（左）與健康梭子蟹（右）血淋巴顯微比較</p><p>　　左：可見(jiàn)大量血卵渦鞭蟲蟲體（1000×）右：示大量

36、正常血細(xì)胞（400×）</p><p>　　Fig 3 Haemolymph of Portunus trituberculatu infected by Hematodinium sp（left 1000×），Haemolymph of healthy Portunus trituberculatu（right 400×）</p><p>　　梭子蟹血清中A

37、CP活性測(cè)定結(jié)果健康梭子蟹與感染梭子蟹差異也達(dá)到極顯著差異的水平，分別為6.131±1.435U/mL、 1.945±0.447 U/mL；SOD、NO測(cè)定結(jié)果也類似，感染組與健康組均呈現(xiàn)極顯著差異。</p><p>　　表1 感染血卵渦鞭蟲的梭子蟹與健康梭子蟹非特異性免疫指標(biāo)比較</p><p>　　Table1. non-specif ic immune fact

38、ors of the healthy and Hematodinium sp infected Portunus trituberculatus </p><p>　　3.2 注射臺(tái)盼藍(lán)染色血卵渦鞭蟲蟲體對(duì)梭子蟹血淋巴的影響</p><p>　　對(duì)健康梭子蟹注射血卵渦鞭蟲蟲體后連續(xù)取樣觀察發(fā)現(xiàn)梭子蟹血淋巴系統(tǒng)對(duì)注射入體內(nèi)的血卵渦鞭蟲蟲體（圖4.1）反應(yīng)十分迅速：5min時(shí)，有大量血細(xì)胞出現(xiàn)

39、聚團(tuán)，血淋巴中未見(jiàn)游離藍(lán)色蟲體顆粒（圖4.2）；30min時(shí)，鰓管中發(fā)現(xiàn)被細(xì)胞團(tuán)包裹的藍(lán)色蟲體塊，最大達(dá)1611μm（圖4.3）。鰓片富集藍(lán)色蟲體，但是未形成包裹塊；1h時(shí)，蟲體循環(huán)至另外一端鰓部，心臟中發(fā)現(xiàn)少許蟲體顆粒，血淋巴中聚團(tuán)細(xì)胞較多，鰓片中蟲體周圍出現(xiàn)包裹細(xì)胞，血液中未見(jiàn)單個(gè)蟲體細(xì)胞（圖4.4）；48h時(shí)，兩端鰓絲均有大量藍(lán)色蟲體，但是以注射一端鰓藍(lán)色蟲體較多，鰓葉中形成明顯包裹團(tuán)（圖4.5）。在對(duì)自然感染血卵渦鞭蟲的梭子蟹鰓

40、小片中也觀察到了類似的包裹團(tuán)結(jié)構(gòu)（圖4.6）。</p><p>　　圖4.1 注射用臺(tái)盼藍(lán)染色的血卵渦鞭蟲蟲體（40×，標(biāo)尺50μm）</p><p>　　Fig 4.1 Hematodinium sp suspension injected into healthy Portunus trituberculatus (bars=50μm) </p><p&

41、gt;　　圖4.2 注射5min后對(duì)照組梭子蟹血淋巴（左 4×）與注射組梭子蟹血淋巴（右，4×）</p><p>　　左：可見(jiàn)均勻分布的正常梭子蟹血細(xì)胞 右：可見(jiàn)大量集群的梭子蟹血細(xì)胞</p><p>　　Fig 4.2 Haemolymph of Portunus trituberculatu after injected with Hematodinium sp.

42、，left shows the healthy haemolymph cells scattered evenly；right shows the obvious angulations in haemolymph cells.</p><p>　　注射處肌肉粘膜上形成大量包裹團(tuán)。血細(xì)胞已經(jīng)沒(méi)有聚團(tuán)現(xiàn)象；45d時(shí)，注射蟲體的蟹依舊活力很好，鰓小片上包裹團(tuán)大部分消失，留下稍許藍(lán)色痕跡；鰓管中殘存藍(lán)色痕跡。血細(xì)胞數(shù)量

43、與對(duì)照組無(wú)顯著差異（見(jiàn)圖4.7）。</p><p>　　圖4.3 注射1h后梭子蟹鰓上開(kāi)始富集藍(lán)色蟲體顆粒</p><p>　　Fig4.3 Gills of Portunus trituberculatu after injected with marked Hematodinium sp.</p><p>　　圖4.3 注射臺(tái)盼藍(lán)染色血卵渦鞭蟲后梭子蟹鰓、肌肉

44、形成的包裹團(tuán)</p><p>　　注射后48h，鰓上出現(xiàn)大量包裹團(tuán)，箭頭示包裹團(tuán)65.94μm；</p><p>　　B.鰓小片放大圖（20×）；</p><p>　　C.注射后48h游泳足基膜內(nèi)部肌肉出現(xiàn)包裹團(tuán)；</p><p>　　D. 包裹團(tuán)放大后可見(jiàn)清晰的蟲體顆粒（標(biāo)尺=20μm）</p><p>　

45、　圖4.4 注射后45d，鰓上大部分包裹團(tuán)被清除（左），鰓絲上殘留染料</p><p>　　Fig 4.4 Mostly angulations on gills of injected Portunus trituberculatu were cleaned </p><p>　　圖4.5 自然感染血卵渦鞭蟲的梭子蟹鰓小片上的包裹團(tuán)，左(10×)，右（400×）<

46、;/p><p>　　Fig 4.5 Angulations on gills of naturally infected Portunus trituberculatu </p><p><b>　　4. 結(jié)論</b></p><p>　　何甲殼類動(dòng)物的非特異性免疫系統(tǒng)通常劃分為細(xì)胞免疫與體液免疫，其中細(xì)胞免疫主要是指血淋巴中血細(xì)胞對(duì)入侵體內(nèi)的異己

47、生物的吞噬包裹等免疫防御作用，而體液免疫則是指各種與免疫相關(guān)的活性酶類，例如酚氧化物酶、酸性磷酸酶、堿性磷酸酶、溶血素、凝集素、溶血素以及各種與抗氧化能力相關(guān)的酶類[8][9]。甲殼類動(dòng)物遭受病原生物侵襲時(shí)，細(xì)胞免疫與體液免疫系統(tǒng)均會(huì)聯(lián)動(dòng)，產(chǎn)生積極的防御。病毒感染斑節(jié)對(duì)蝦[10]和日本囊對(duì)蝦[11]后,血淋巴生理變化特點(diǎn)最典型的就是是對(duì)蝦開(kāi)放循環(huán)系統(tǒng)的血細(xì)胞數(shù)量急劇下降,血淋巴凝結(jié)功能下降,說(shuō)明由于大量血細(xì)胞參與了對(duì)病毒的清除，血細(xì)胞的

48、大量減少說(shuō)明宿主的自身的免疫防御能力已經(jīng)大大下降。本文對(duì)感染血卵渦鞭蟲的梭子蟹血細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)瀕臨死亡的個(gè)體血細(xì)胞含量極低，甚至有的個(gè)體未檢出血細(xì)胞，而代之以大量的血卵渦鞭蟲蟲體，而健康蟹血細(xì)胞數(shù)則高達(dá)2.7×107cells/mL。這說(shuō)明大量梭子蟹血細(xì)胞在感染期參與了血卵渦鞭蟲蟲體的清除，造成了血細(xì)胞數(shù)量的嚴(yán)重?fù)p失，提示可以將血細(xì)胞數(shù)量作為梭子蟹健康程度及抗病能力的評(píng)估指標(biāo)。</p><p>　　機(jī)

49、體免疫防御體系的抗氧化能力的強(qiáng)弱與健康程度存在較為密切的聯(lián)系，而抗氧化系統(tǒng)可劃分為酶促和非酶促兩個(gè)體系，其中酶促抗氧化酶系統(tǒng)包括：超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶等；非酶促抗氧化體系則是各種維生素、氨基酸及金屬蛋白質(zhì)等。肝胰腺是梭子蟹體內(nèi)最大的消化器官，其功能的正常運(yùn)行直接關(guān)系到梭子蟹健康。本研究發(fā)現(xiàn)感染血卵渦鞭蟲的梭子蟹肝胰腺中總抗氧化能力較健康梭子蟹差，說(shuō)明血卵渦鞭蟲的大量寄生會(huì)導(dǎo)致肝胰腺中抗氧化體系的逐漸崩潰，推測(cè)可

50、能會(huì)影響肝胰腺對(duì)食物的消化功能，這有待后續(xù)研究加以驗(yàn)證。</p><p>　　甲殼類動(dòng)物的體液中一些代表性的酶與機(jī)體免疫力直接相關(guān)：例如ACP是磷酸會(huì)伴隨著血細(xì)胞的防御性吞噬、包裹反應(yīng)而釋放，在生物體內(nèi)參加磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移代謝[12]；SOD</p><p>　　是機(jī)體內(nèi)保護(hù)酶系統(tǒng)中的關(guān)鍵性酶, 對(duì)機(jī)體的氧化與抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用，其可清除機(jī)產(chǎn)生的活性氧自由基, 使機(jī)體細(xì)胞免受氧化損

51、傷[13]；NO是生物體內(nèi)NO由一氧化氮合成酶（NOS）催化產(chǎn)生，NOS常存在于吞噬細(xì)胞中，催化L-精氨酸產(chǎn)生一氧化氮，從而產(chǎn)生不同類型的活性氮中間體，參與免疫防御反應(yīng)[14] [15]，因此這些指標(biāo)可以用于機(jī)體免疫力的評(píng)估。本研究對(duì)感染血卵渦鞭蟲的梭子蟹與健康梭子蟹血淋巴中ACP、SOD、NO進(jìn)行測(cè)定的結(jié)果顯示，患病梭子蟹這幾項(xiàng)指標(biāo)均極顯著低于健康梭子蟹，說(shuō)明梭子蟹感染血卵渦鞭蟲后免疫防御系統(tǒng)遭到嚴(yán)重破壞。而且在進(jìn)行解剖及檢測(cè)過(guò)程中還

52、發(fā)現(xiàn)血淋巴中血卵渦鞭蟲數(shù)量較低，血細(xì)胞量較高的樣本則上述指標(biāo)值相對(duì)較高，血細(xì)胞幾乎不可檢出代之以大量蟲體的樣本則各項(xiàng)指標(biāo)值均較低。說(shuō)明隨著血卵渦鞭蟲感染程度的加深，梭子蟹的體液免疫系統(tǒng)也遭到逐步的破壞。有研究顯示甲殼類在感染疾病初期由于免疫系統(tǒng)的積極響應(yīng)，各項(xiàng)免疫酶活性反而會(huì)增高，但如果未能成功清除病原，隨著感染程度加深則免疫酶活性會(huì)逐漸降低，直到死亡，這與本研究結(jié)果基本一致。</p><p>　　血卵渦鞭蟲是一

53、種與梭子蟹血細(xì)胞大小相當(dāng)?shù)募纳x，梭子蟹感染該寄生蟲后，細(xì)胞防御的最主要方式是進(jìn)行特異性包裹，然后調(diào)動(dòng)各種免疫酶系統(tǒng)進(jìn)行殺滅[16]。本研究將臺(tái)盼藍(lán)染色的血卵渦鞭蟲直接注射入梭子蟹體內(nèi)，利用其特定顏色進(jìn)行示蹤，直觀的反映蟲體在梭子蟹體內(nèi)的清除路線，研究證實(shí)梭子蟹細(xì)胞免疫系統(tǒng)對(duì)注射入體內(nèi)的異物響應(yīng)速度非常迅速，在5min時(shí)即形成了大量的包裹團(tuán)，包裹團(tuán)在注射部位肌肉組織間與鰓部均觀察到，尤其是在鰓小片上形成了大量的包裹團(tuán)，大顆粒細(xì)胞、小顆粒

54、細(xì)胞、透明細(xì)胞均參與了包裹團(tuán)的形成，經(jīng)過(guò)較長(zhǎng)時(shí)間蟲體顆粒最終被清除。說(shuō)明梭子蟹的鰓部是清除較大顆粒型異物的主要器官之一。本研究注射的蟲體經(jīng)滅活處理，可能已經(jīng)改變其表面抗原結(jié)構(gòu)，但是梭子蟹免疫防御系統(tǒng)能迅速識(shí)別并響應(yīng)，但是在自然感染的某些蟹鰓小片上也發(fā)現(xiàn)了很多類似的包裹團(tuán)結(jié)構(gòu)，說(shuō)明有部分血卵渦鞭蟲被血細(xì)胞識(shí)別并進(jìn)行包裹清除，但是還是有很大一部分血卵渦鞭蟲未能被成功清除。即在自然感染狀態(tài)下，似乎這種免疫防御機(jī)制對(duì)有些活的血卵渦鞭蟲失去了作用

55、，推測(cè)活體血卵渦鞭蟲抗原可能存在某種特殊機(jī)制躲避梭子蟹的免疫系統(tǒng)進(jìn)而大量繁殖導(dǎo)致梭子蟹的死亡，這有待進(jìn)一步</p><p><b>　　致謝</b></p><p>　　在我的實(shí)驗(yàn)以及論文的撰寫過(guò)程中，許多人給了我非常大的幫助，使我克服了許多困難，才能順利的完成我的論文。在這里，我對(duì)許老師，謝老師，王老師，張老師以及其他在我的論文完成過(guò)程中所有幫助過(guò)我的人表示由衷的謝

56、意。</p><p><b>　　[參考文獻(xiàn)]</b></p><p>　　[1]俞存根, 宋海棠，姚光展等. 浙江近海蟹類資源合理利用研究[J]，海洋漁業(yè)，2003，25（3）：136-141</p><p>　　[2] 許文軍，徐漢祥，Jeff Shield等.海產(chǎn)甲殼類血卵渦鞭蟲病研究.進(jìn)展[J]，中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)，2007,14(4:):6

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