畢業(yè)論文lactic acid yield γ-amino butyric acid plasma breeding

1、<p>　　Lactic acid yield γ-amino butyric acid plasma Breeding</p><p><b>　　ABSTRACT</b></p><p>　　γ-amino butyric acid (γ-amino butyric acid,abbreviated GABA) is a non-protein amin

2、o acids are widely distributed in nature,it has analgesic and to promote growth hormone secretion and prevention of Alzheimer's and other physiological function.</p><p>　　To improve the production of GAB

3、A,the Atmospheric and Room Temperature Plasma(ARTP) was used to mutagenesis HX-3-6 (the strain keep in the experiment),and then mutations was used for future fermentation whose fatality rate were above 90%, the gradien

4、t plate with GABA and the size of the colony were used for the first screening,and then fermentation medium was used for the next screening to test the genetic stability of mutant strains of lactic acid bacteria .Obtaine

5、d stable mutants L-120-1 and</p><p>　　Keyword: Lactobacillus;GABA ;Ferment ;Genetic stability</p><p>　　高產(chǎn)γ-氨基丁酸乳酸菌的等離子誘變選育</p><p><b>　　摘 要</b></p><p>　　γ

6、-氨基丁酸（γ-amino butyric acid，簡(jiǎn)稱GABA )是廣泛分布于自然界的一種非蛋白質(zhì)氨基酸，具有鎮(zhèn)痛、促進(jìn)生長(zhǎng)激素分泌及預(yù)防老年癡呆等生理功能。 </p><p>　　為提高GABA產(chǎn)量 ，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用常溫室壓等離子體（ Atmospheric and Room Temperature Plasma，簡(jiǎn)稱ARTP ）對(duì)實(shí)驗(yàn)室已有菌株HX-3-6進(jìn)行誘變，挑選致死率達(dá)到90%以上的菌株進(jìn)行發(fā)酵驗(yàn)證，

7、并通過(guò)梯度平板按GABA濃度的高低以及菌落的大小進(jìn)行初篩，再利用發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行復(fù)篩并進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)。獲得的穩(wěn)定突變株L-120-1且產(chǎn)量達(dá)到5.828g/L，較誘變前產(chǎn)量（4.904）提高18.84%。以突變株L-120-1為出發(fā)菌株進(jìn)行ARTP誘變，得的穩(wěn)定突變株90s-高2產(chǎn)量達(dá)到6.178g/L，較誘變前產(chǎn)量(5.319g/L)提高16.15%。最終得到穩(wěn)定高產(chǎn)GABA的乳酸菌突變菌株90s-高2產(chǎn)GABA比誘變前的HX-3-

8、6菌株產(chǎn)量提高 25.98%。</p><p>　　關(guān)鍵詞：乳酸菌；GABA；ARTP；發(fā)酵；遺傳穩(wěn)定</p><p><b>　　插圖清單</b></p><p>　　圖2-1 GABA的酶標(biāo)儀標(biāo)準(zhǔn)曲線…………………………………………………12</p><p>　　圖3-1 HX-3-6的生長(zhǎng)曲線……………………………

9、………………………13</p><p>　　圖3-2 HX-3-6的誘變致死率曲線圖…………………………………………14</p><p>　　圖3-3 HX-3-6誘變后GABA的產(chǎn)量……………………………………………15</p><p>　　圖3-4 L-120-1的生長(zhǎng)曲線和Ph值曲線………………………………………16</p><p>　

10、　圖3-5 L-120-1的誘變致死率曲線……………………………………………17</p><p>　　圖3-6 L-120-1誘變后菌株的GABA產(chǎn)量和OD值的曲線…………………18</p><p><b>　　表格清單</b></p><p>　　表1-1實(shí)驗(yàn)藥品（試劑）……………………………………………………6</p><

11、;p>　　表1-2試驗(yàn)儀器……………………………………………………………7</p><p>　　表4-1 乳酸菌HX-3-6 所測(cè)OD600值………………………………………22</p><p>　　表4-2 乳酸菌HX-3-6誘變致死率……………………………………………22</p><p>　　表4-3 乳酸菌HX-3-6誘變后GABA的產(chǎn)量………………………

12、……………22</p><p>　　表4-4 乳酸菌L-120-1所測(cè)的OD600 和pH值……………………………………23</p><p>　　表4-5 乳酸菌L-120-1誘變致死率…………………………………………23</p><p>　　表4-6 乳酸菌L-120-1誘變后GABA產(chǎn)量……………………………………23</p><p>&

13、lt;b>　　引言</b></p><p>　　γ-氨基丁酸(γ-amino butyric acid，GABA)是一種廣泛分布于動(dòng)植物體內(nèi)的非蛋白氨基酸，具有許多重要的生理功能。在植物中，γ-氨基丁酸(GABA)參與了植物抵御逆境脅迫反應(yīng)，對(duì)病蟲害的保衛(wèi)反應(yīng)等過(guò)程。在動(dòng)物中，GABA作為哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)一種主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，參與腦循環(huán)生理活動(dòng)，具有降低血壓、治療癲病、鎮(zhèn)靜安神、促進(jìn)睡眠

14、、增強(qiáng)記憶力、控制哮喘、調(diào)節(jié)激素分泌、促進(jìn)生殖、腎肝功能活化等功能，被廣泛的應(yīng)用于食品、醫(yī)藥等工業(yè)。因此對(duì)其作用機(jī)理、制備研究己經(jīng)成為一個(gè)熱點(diǎn)。目前主要通過(guò)大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)GABA，但大腸桿菌存在著安全衛(wèi)生方面的極大隱患。因此通過(guò)誘變的方法獲得高產(chǎn)GABA的安全性新型菌種具有重要的意義[1~3]。</p><p>　　在食品和醫(yī)藥工業(yè)中，利用公認(rèn)的安全性益生菌——乳酸菌進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)GABA具有更廣泛的前景，目前工

15、業(yè)生產(chǎn)的GABA產(chǎn)量較低[4，5]，故為提高GABA產(chǎn)量本實(shí)驗(yàn)采用等離子誘變?nèi)樗峋N選育</p><p>　　紫外線是一種最常用有效的物理誘變因素，其誘變效應(yīng)主要是由于它引起DNA結(jié)構(gòu)的改變而形成突變型[6]。但是紫外誘變育具有育種過(guò)程繁重，誘變效果差等問(wèn)題。</p><p>　　化學(xué)誘變是通過(guò)采用一些分子結(jié)構(gòu)不太穩(wěn)定的化學(xué)誘變劑進(jìn)行的，它通過(guò)化學(xué)試劑造成生物的損傷和錯(cuò)誤修復(fù)，產(chǎn)生突變體

16、[7]。但是化學(xué)誘變育種過(guò)程復(fù)雜以及具有對(duì)人體危害比較大的操作環(huán)境。</p><p>　　本實(shí)驗(yàn)采用一種新型微生物誘變育種方法--常壓室溫等離子體（ARTP)誘變育種系統(tǒng)。ARTP是近幾年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種等離子體源，能夠在大氣壓下產(chǎn)生溫度在25-40℃之間的、具有高活性粒子濃度的等離子體射流，等離子體具有氣溫低、電子溫度高的非平衡特性以及活性離子濃度高的特點(diǎn)。據(jù)科學(xué)研究表明，等離子體中的活性粒子作用于微生物，能夠

17、使微生物細(xì)胞壁/膜的結(jié)構(gòu)及通透性改變，并引起基因損傷，進(jìn)而使微生物基因序列及其代謝網(wǎng)絡(luò)顯著變化，最終導(dǎo)致微生物產(chǎn)生突變[8]。</p><p>　　ARTP誘變育種系統(tǒng)具有操作安全、過(guò)程簡(jiǎn)單、突變率高、經(jīng)濟(jì)環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)；所以本實(shí)驗(yàn)利用ARTP對(duì)產(chǎn)GABA的乳酸菌進(jìn)行誘變育種將誘變后的突變菌株用含有代謝產(chǎn)物GABA的培養(yǎng)基進(jìn)行抗性初篩，再利用發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行復(fù)篩進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)，最終得到穩(wěn)定高產(chǎn)GABA的乳酸菌突變菌

18、株。</p><p><b>　　第一章 緒論</b></p><p>　　1.1 γ-氨基丁酸的研究現(xiàn)狀</p><p>　　GABA在食品中的研究和應(yīng)用始于上世紀(jì)八十年代中期，應(yīng)用產(chǎn)品以日本茶飲料Gabaron為代表。用Gabaron茶飲料飼喂患原發(fā)性高血壓的小白鼠，數(shù)周內(nèi)發(fā)現(xiàn)其血壓由175-180mmHg降低至150mmHg，同時(shí)并未發(fā)

19、現(xiàn)小白鼠的其它任何生理異?，F(xiàn)象[9]。1994年，Takayo等在研究用水浸泡的米胚芽的氨基酸分布時(shí)，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)發(fā)酵處理的米胚芽中GABA的積累量很高，達(dá)到200-300mg/100g[10]。1996年，富含GABA的米胚芽制品在日本實(shí)現(xiàn)了商業(yè)化。神經(jīng)生理及神經(jīng)醫(yī)學(xué)的研究表明GABA是一種重要的活性物質(zhì)，在人腦中，雖然GABA可由腦部的谷氨酸在專一性較強(qiáng)的谷氨酸脫羧酶作用下轉(zhuǎn)化而成，但是年齡的增長(zhǎng)和精神壓力的加大使GABA的積累異常困難

20、，而通過(guò)日常飲食補(bǔ)充可有效改善這種狀況，從而促進(jìn)人體健康[11]。</p><p>　　最近，日本科學(xué)家利用米胚芽等原料開發(fā)制造的富含GABA的功能食品配料，已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于飲料、果醬、糕點(diǎn)、餅干、調(diào)味料等制品中。現(xiàn)在還有報(bào)道，應(yīng)用生物技術(shù)制造的高濃度GABA飲料以及利用乳酸菌等制作的富含GABA的食品配料，均可直接作為或者用于抗高血壓、增進(jìn)腦機(jī)能及肝功能的功能食品。我國(guó)有關(guān)GABA食品的研究開發(fā)報(bào)道極少，這方面

21、的研究開發(fā)尚屬于起步階段。</p><p>　　1.2 常壓室溫等離子誘變系統(tǒng)</p><p>　　1.2.1 ARTP生物育種基本原理</p><p>　　常壓低溫等離子體是近幾年才開始研究的一種新型等離子體源，具有氣體溫度低、活性粒子濃度高、能量高、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)?；A(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究表明，常壓低溫等離子體中的高濃度活性粒子能夠作用于微生物的遺傳物質(zhì)，使其在短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生

22、致畸突變，是一種效果良好的誘變?cè)碵12]。相比傳統(tǒng)的物理誘變方法（如離子束注入、放射線誘變）和化學(xué)誘變方法，常壓低溫等離子體誘變方法具有操作安全、簡(jiǎn)便、對(duì)人體無(wú)任何副作用、對(duì)環(huán)境無(wú)污染等特點(diǎn)。 </p><p>　　1.2.2 ARTP的發(fā)展優(yōu)勢(shì)</p><p>　　常規(guī)的誘變育種方法有化學(xué)誘變育種和物理誘變育種。 微生物的誘變育種，主要是以人工誘變的手段來(lái)誘發(fā)微生物基因突變，從而改變遺傳

23、結(jié)構(gòu)和功能，再通過(guò)篩選，從很多的變異菌體中篩選出所需的產(chǎn)量高、性狀優(yōu)良的突變株，并且找出最佳培養(yǎng)基及最佳培養(yǎng)條件，使其能在最適環(huán)境條件下合成所需產(chǎn)物。</p><p>　　清華大學(xué)等離子體健康科技研究組（工程物理系）、環(huán)境生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室（化學(xué)工程系）聯(lián)合北京思清源生物科技有限公司，采用國(guó)際先進(jìn)的常壓低溫等離子體產(chǎn)生技術(shù)，結(jié)合近幾年的最新研究成果與自動(dòng)控制方法，聯(lián)合研制出第二代ARTP生物育種機(jī)。該育種機(jī)具有工作穩(wěn)

24、定、無(wú)需預(yù)熱、操作簡(jiǎn)便、人機(jī)交互性能好等優(yōu)點(diǎn)，能夠在工業(yè)環(huán)境下產(chǎn)生常壓低溫等離子體使菌種產(chǎn)生誘變，加快誘變育種進(jìn)程，提高工業(yè)生產(chǎn)效率[13]。</p><p>　　ARTP誘變的研究能夠促進(jìn)等離子體與生物科學(xué)的融合和交叉，一方面推動(dòng)具有多參數(shù)、高通量、可控性更強(qiáng)的多通道的常壓低溫等離子體技術(shù)裝備的發(fā)展與創(chuàng)新，另一方面，通過(guò)對(duì)不同生物分子及物種的調(diào)控與作用方法研究，形成了等離子體生物技術(shù)（Plasma biotec

25、hnology）的新研究領(lǐng)域--生命科學(xué)。</p><p>　　1.3 立題依據(jù)與意義</p><p>　　γ-氨基丁酸(γ-amino butyric acid，GABA)是一種非蛋白質(zhì)氨基酸，是哺乳動(dòng)物中樞的一種抑制性遞質(zhì)，GABA具有降血壓、增強(qiáng)記憶力、活化腎功能、改善肝功能、防治肥胖、營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞等作用等諸多功能[14]，研究通過(guò)微生物發(fā)酵法獲得GABA具有重要意義。</p&

26、gt;<p>　　隨著GABA的生理功能特性逐漸被人類認(rèn)識(shí)，利用GABA的富集技術(shù)開發(fā)富含GABA的保健食品必將是一個(gè)很有潛力的研究領(lǐng)域，化學(xué)合成GABA安全性較差，植物富集GABA含量不高，利用生物合成法中的微生物(乳酸菌)發(fā)酵生產(chǎn)GABA顯示了廣闊的開發(fā)前景[15]。但是乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)GABA的工業(yè)產(chǎn)量不高。</p><p>　　鑒于紫外誘變育種具有育種過(guò)程繁重，誘變效果差等問(wèn)題；化學(xué)誘變育種過(guò)程

27、復(fù)雜以及具有對(duì)人體危害比較大的操作環(huán)境。</p><p>　　本實(shí)驗(yàn)利用新型誘變技術(shù)（常壓室溫等離子體誘變育種系統(tǒng)）對(duì)乳酸菌進(jìn)行誘變育種，從而得到高產(chǎn)GABA的乳酸菌菌種。</p><p>　　1.4 本課題主要研究的內(nèi)容</p><p>　?。?)本實(shí)驗(yàn)對(duì)實(shí)驗(yàn)室已篩選出的產(chǎn)γ-氨基丁酸的乳酸菌進(jìn)行常溫室壓等離子體誘變，并使用梯度平板對(duì)誘變株進(jìn)行初步篩選。</

28、p><p>　　(2)對(duì)大量突變株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)復(fù)篩，以期獲得生長(zhǎng)速率快，高產(chǎn)γ-氨基丁酸的乳酸菌。</p><p><b>　　第2章 實(shí)驗(yàn)材料</b></p><p><b>　　2.1 菌種來(lái)源</b></p><p>　　由安徽蕪湖安徽工程大學(xué)生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室保藏，編號(hào)為HX-3-6。</p

29、><p><b>　　2.2 實(shí)驗(yàn)藥品</b></p><p>　　表1-1-實(shí)驗(yàn)藥品（試劑）</p><p><b>　　2.3 實(shí)驗(yàn)儀器</b></p><p><b>　　表1-2-試驗(yàn)儀器</b></p><p>　　本試驗(yàn)還需用品：Eppendor

30、f離心管、燒杯、玻璃棒、鑷子、試劑瓶、量筒、洗瓶、石棉網(wǎng)、錐形瓶、培養(yǎng)皿、剪刀、白鐵鍋、酒精燈、試管架、冰袋、試劑勺、涂布棒、甘油管等。</p><p>　　2.4 培養(yǎng)基及相關(guān)試劑的配制</p><p>　?。?）MRS液體培養(yǎng)基：魚粉蛋白胨10g 酵母提取物10g 葡萄糖5g 乙酸鈉5g 磷酸氫二鉀0.2g 檸檬酸三胺0.2g 硫酸鎂0.2g 硫酸錳0.05g 吐溫-80

31、0.1mol/L 水1000mL pH6.5 115℃滅菌25分鐘</p><p>　?。?）MRS固體培養(yǎng)基：魚粉蛋白胨10g 酵母提取物10g 葡萄糖5g 乙酸鈉5g 磷酸氫二鉀0.2g 檸檬酸三胺0.2g 硫酸鎂0.2g 硫酸錳0.05g 瓊脂20～25g 水1000mL pH6.5 115℃滅菌25分鐘</p><p>　?。?）含GABA的MRS固體培養(yǎng)

32、基：魚粉蛋白胨10g 酵母提取物10g 葡萄糖5g 乙酸鈉5g 磷酸氫二鉀0.2g 檸檬酸三胺0.2g 硫酸鎂0.2g 硫酸錳0.05g 瓊脂20～25g GABA 60g 水1000mL pH6.5 115℃滅菌25分鐘</p><p>　?。?）發(fā)酵培養(yǎng)基：酵母提取物5g 胰蛋白胨5g 葡萄糖10g 丁二酸鈉5g 1%的谷氨酸鈉 水1000mL pH6.5 115℃滅菌2

33、5分鐘</p><p>　?。?）生理鹽水溶液：1.8gNaCl溶于200mL蒸餾水。115℃滅菌25min。</p><p>　?。?）硼酸緩沖液1.525g硼砂和0.247g硼酸溶解后定容至100mL。</p><p>　　(3)谷氨酸鈉溶液：0.1g的谷氨酸鈉加入100mL的無(wú)菌水中，配制用于對(duì)照的谷氨酸鈉溶液。</p><p><

34、;b>　　第3章 實(shí)驗(yàn)方法</b></p><p>　　3.1 對(duì)乳酸菌HX-3-6進(jìn)行ARTP誘變育種</p><p>　　3.1.1 乳酸菌HX-3-6生長(zhǎng)曲線的測(cè)定</p><p>　　（1）菌種的活化：將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株取出，并恢復(fù)至室溫后，按10%（v/v）接種量接種1mL乳酸菌于裝有9mL 的 MRS液體種子培養(yǎng)基的50mL三角瓶中，靜置

35、于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h待用。</p><p>　?。? ）乳酸菌生長(zhǎng)曲線繪制：取出上述活化后的菌懸液，按10%（v/v）接種量接種接種1mL菌懸液到裝有9mL MRS液體培養(yǎng)基的50mL三角瓶，置于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔3h用分光光度計(jì)在600nm條件下測(cè)得菌液OD值，并以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)繪制乳酸菌的生長(zhǎng)曲線。 </p><p>　　同時(shí)用pH計(jì)對(duì)乳酸菌菌懸液的pH值進(jìn)行

36、測(cè)定。</p><p>　　3.1.2 ARTP誘變</p><p>　?。?） 菌懸液的制備：將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株取出，并恢復(fù)至室溫后，按10%（v/v）接種量接種1mL乳酸菌于裝有9mlL的 MRS液體種子培養(yǎng)基的50mL三角瓶中，靜置于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)待用，取1mL待用菌液于1.5ml的離心管中，5000r/min離心5分鐘，離心后去除上清液加入1mL的無(wú)菌水使用振蕩器震動(dòng)搖勻，制成菌懸

37、液備用。</p><p>　?。?） ARTP誘變操作：在無(wú)菌操作臺(tái)上使用20μL移液槍吸取上述制備好的菌懸液10μL到滅菌的小鐵片上（共做8組），8組菌液用ARTP進(jìn)行誘變處理的時(shí)間分別為0s、30s、 60s、 90s、 120s、 150s、 180s、210s、240s。</p><p>　　常壓室溫（ ARTP ）等離子誘變育種裝置，在本實(shí)驗(yàn)中使用條件如下所述；供電電源：220V

38、，50Hz，電壓波動(dòng)范圍 ≤ 5% ，氣體流量選用10SLM，溫度20～40℃以下，功率200W。</p><p>　　用鑷子將待處理樣品載片放置到旋轉(zhuǎn)定位臺(tái)上方菌片固定圓形凹槽內(nèi)，之后調(diào)節(jié)旋轉(zhuǎn)定位臺(tái)高度，使待處理樣品距離等離子體發(fā)生器出口為 3 mm，樣品放置完畢后，關(guān)閉操作室門，選擇照射時(shí)間。</p><p>　　3.1.3 后培養(yǎng)及平板計(jì)數(shù)</p><p>　

39、?。?）后培養(yǎng)：將誘變后的載有菌液的小鐵片迅速放入裝有1.5mL MRS液體培養(yǎng)基的離心管中，然后將誘變的乳酸菌放入恒溫培養(yǎng)箱中30℃培養(yǎng)2h。</p><p>　?。?）平板計(jì)數(shù)：2h后取出誘變菌液使用振蕩器將離心管中的菌液混勻，用1000μL移液槍吸取0.5mL置于裝有4.5mL生理鹽水的7mL離心管中，依次稀釋至10-3、10-4、10-5、10-6，取稀釋倍數(shù)10-4、10-5的兩個(gè)梯度菌懸液（0s取稀釋

40、倍數(shù)為10-5、10-6的兩個(gè)梯度菌懸液涂布平板），用200μL移液槍吸取100μL加入MRS平板，涂布均勻，每個(gè)稀釋度做三個(gè)平行。將涂布后的平板倒置放入恒溫培養(yǎng)箱中，30℃培養(yǎng)72h。</p><p>　?。?）ARTP致死率的計(jì)算：培養(yǎng)72h后對(duì)平板上的菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)，并與相對(duì)應(yīng)濃度的對(duì)照組菌落數(shù)目進(jìn)行對(duì)照，按照公式：致死率=（對(duì)照組-誘變菌落數(shù)）/對(duì)照菌落數(shù)，計(jì)算致死率。</p><p&g

41、t;　　3.1.4 突變株的篩選</p><p>　　（1） 梯度平板的制備：在無(wú)菌操作臺(tái)，先將平板傾斜15度左右放置，倒入約10mL MRS瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后放回水平位置，再倒入等體積的含有GABA濃度為60g/L的MRS培養(yǎng)基，凝固后形成梯度平板備用。</p><p>　?。?） 突變菌株的初篩：將誘變后菌株分別稀釋10-4、10-5涂布梯度平板，將涂布后的梯度平板倒置放入恒溫培養(yǎng)箱

42、中，30℃培養(yǎng)72h（0s不需要涂布梯度平板）。培養(yǎng)72h后按GABA濃度以及菌落的大小挑選單菌落；驗(yàn)證菌落大小和抗GABA濃度高低與菌株產(chǎn)GABA的相關(guān)性。</p><p>　　（3）突變菌株的復(fù)篩：對(duì)突變菌株利用發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行復(fù)篩，發(fā)酵條件為裝液量50mL的250mL的三角瓶。在恒溫培養(yǎng)30℃靜置培養(yǎng)72h；72h后在640nm條件利用酶標(biāo)儀測(cè)突變菌株發(fā)酵產(chǎn)GABA的產(chǎn)量。</p><p&

43、gt;　　3.1.5 GABA含量的測(cè)定</p><p>　　取1ml發(fā)酵液于1.5mL離心管中10000r/min離心2min，吸取0.5mL上清液用無(wú)菌水稀釋10倍備用。</p><p>　　取0.8mL備用液于平底試管中。再依次分別加入1mol/L的碳酸鈉溶液0.2mL，0.2ml/L Ph10.0的硼酸鹽緩沖液0.75mL，6%的重蒸苯酚2.5mL，混勻后加入次氯酸鈉(NaClO

44、)溶液2mL，混勻后放置4～8分鐘，然后沸水浴10min，立即冰浴20min，待溶液出現(xiàn)藍(lán)綠色后，加入4mL 60%的乙醇溶液，混勻后室溫3放置20min，待上述溶液制作好后，從每組溶液中吸取200μL加入到酶標(biāo)板上，用酶標(biāo)儀在640nm條件下對(duì)每組溶液進(jìn)行GABA的含量測(cè)定；用酶標(biāo)儀測(cè)定GABA的標(biāo)準(zhǔn)。</p><p>　　圖3-1 GABA的酶標(biāo)儀標(biāo)準(zhǔn)曲線</p><p>　　3.1.

45、6 菌種保藏</p><p>　　對(duì)反復(fù)篩選并經(jīng)過(guò)多次傳代得到的高產(chǎn)GABA的乳酸菌突變菌株用甘油管在-70℃進(jìn)行冷凍保種。</p><p>　　3.2 對(duì)乳酸菌L-120-1進(jìn)行ARTP誘變育種</p><p>　　3.2.1 菌種來(lái)源</p><p>　　L-120-1是原始菌株HX-3-6菌株經(jīng)過(guò)ARTP誘變處理后，篩選得到的遺傳性及產(chǎn)

46、量穩(wěn)定的突變菌株。</p><p>　　3.2.2 實(shí)驗(yàn)操作基本流程</p><p>　　菌種的活化 → 乳酸菌生長(zhǎng)曲線繪制 → 菌懸液的制備 → ARTP誘變操作 → 后培養(yǎng) → 平板計(jì)數(shù) → ARTP致死率的計(jì)算 → 突變菌株的篩選 → GABA含量的測(cè)定 → 菌種保藏。</p><p>　　第4章 結(jié)果與討論</p><p>　　4

47、.1 乳酸菌HX-3-6 ARTP誘變結(jié)果 </p><p>　　4.1.1 HX-3-6生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 </p><p>　　圖4-1 HX-3-6的生長(zhǎng)曲線</p><p><b>　　圖表分析：</b></p><p>　　乳酸菌HX-3-6乳酸菌經(jīng)過(guò)活化處理后，使用分光光度計(jì)在A600條件下制成HX-3-6乳

48、酸菌生長(zhǎng)曲線如圖4-1所示， 由圖可以看出，菌體在接種培養(yǎng)后經(jīng)過(guò)短暫的適應(yīng)期進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，約在18h左右進(jìn)入對(duì)數(shù)后期，此期間菌體生長(zhǎng)代謝旺盛且穩(wěn)定是誘變的最佳時(shí)機(jī)。同時(shí)可以看出菌株約在21h后進(jìn)入穩(wěn)定期。</p><p>　　4.1.2 乳酸菌HX-3-6致死率測(cè)定</p><p>　　圖4-2 HX-3-6的誘變致死率曲線圖</p><p>　　由圖4-2可以看

49、出：HX-3-6乳酸菌經(jīng)過(guò)ARTP誘變處理后，乳酸菌誘變致死率隨著菌株誘變時(shí)間的增長(zhǎng)而增大。90s的致死率在77.81%，120s的致死率在91.2%；實(shí)驗(yàn)中挑取致死率達(dá)到90%的菌株進(jìn)行篩選，以期獲得高產(chǎn)菌株。</p><p>　　4.1.3 HX-3-6誘變后GABA含量的測(cè)定</p><p>　　圖4-3 HX-3-6誘變后GABA的產(chǎn)量</p><p>　　

50、由圖4-3可以看出，經(jīng)過(guò)第一次誘變之后發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比大部分經(jīng)過(guò)誘變的菌株產(chǎn)GABA的產(chǎn)量有所提高；其中120-1 GABA的產(chǎn)量為5.828g/L；GABA產(chǎn)量最高的突變菌株l-120-1較誘變前產(chǎn)量提高18.84%。并經(jīng)過(guò)多次傳代產(chǎn)量穩(wěn)定。</p><p>　　4.2 乳酸菌L-120-1 ARTP誘變結(jié)果</p><p>　　4.2.1 L-120-1生長(zhǎng)曲線的繪制</p&g

51、t;<p>　　圖4-4 L-120-1的生長(zhǎng)曲線和pH值曲線</p><p>　　乳酸菌 L-120-1生長(zhǎng)曲線如圖4-4所示， 由圖可以看出，菌體在接種培養(yǎng)后經(jīng)過(guò)短暫的適應(yīng)期進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，約在14h左右進(jìn)入對(duì)數(shù)后期，此期間菌體生長(zhǎng)代謝旺盛且穩(wěn)定是誘變的最佳時(shí)機(jī)。同時(shí)可以看出菌株約在18h后進(jìn)入穩(wěn)定期。乳酸菌L-120-1由于是乳酸菌HX-3-6誘變選育后的穩(wěn)定高產(chǎn)菌株，L-120-1乳酸菌的基

52、因較HX-3-6乳酸菌的基因可能發(fā)生改變，所以L-120-1乳酸菌生長(zhǎng)曲線與HX-3-6乳酸菌的生長(zhǎng)曲線有所差別。乳酸菌L-120-1經(jīng)過(guò)上述步驟活化處理后，使用pH計(jì)測(cè)出乳酸菌L-120-1培養(yǎng)時(shí)pH變化如圖4-4所示，在培養(yǎng)時(shí)間為0～24h之間培養(yǎng)菌液中Ph值從6.5一直在降低5.0。培養(yǎng)時(shí)間在24h之后培養(yǎng)菌液中Ph值基本保持不變;與HX-3-6培養(yǎng)過(guò)程中pH基本保持不變有明顯的區(qū)別，而L-120-1的pH和生長(zhǎng)曲線走勢(shì)存在相關(guān)性

53、，可能是由于基因改變導(dǎo)致的結(jié)果。</p><p>　　4.2.2 L-120-1致死率測(cè)定</p><p>　　圖4-5 L-120-1的誘變致死率曲線</p><p>　　由圖4-5可以看出：L-120-1乳酸菌經(jīng)過(guò)ARTP誘變處理后，乳酸菌誘變致死率隨著菌株誘變時(shí)間的增長(zhǎng)而增大。乳酸菌菌株在誘變時(shí)間為90s時(shí)致死率為95.8%，挑取90s梯度平板上突變菌株進(jìn)行初

54、篩與復(fù)篩。</p><p>　　4.2.3 L-120-1誘變后在90s GABA含量測(cè)定</p><p>　　圖4-6 L-120-1誘變后菌株的GABA含量和OD值的曲線</p><p>　　圖4-6中90s-低1，90s代表誘變時(shí)間，低代表GABA低濃度（中代表中濃度，高代表高濃度)，1代表菌落較大（2代表菌落適中，3代表菌落較?。膱D4-6可以看出L-12

55、0-1乳酸菌誘變篩選后與對(duì)照組相比，90s-高1，90s-高2突變株產(chǎn)GABA的產(chǎn)量明顯提高，產(chǎn)量分別為6.116g/L、6.178g/L，較誘變前GABA的產(chǎn)量分別提高14.98%，16.15%。</p><p>　　本實(shí)驗(yàn)為獲得生長(zhǎng)較快且GABA產(chǎn)量高的菌株，但對(duì)突變菌株OD值進(jìn)行測(cè)定與GABA的產(chǎn)量相關(guān)性表現(xiàn)不明顯，即GABA的產(chǎn)量較高的并沒(méi)有表現(xiàn)出較高的OD值，因此，有待于進(jìn)一步的誘變篩選。</p&

56、gt;<p><b>　　結(jié)論與展望</b></p><p>　　微生物育種的目的就是要把生物合成的代謝途徑朝人們所希望的方向加以引導(dǎo)， 或者促使細(xì)胞內(nèi)發(fā)生基因突變后優(yōu)化遺傳性狀， 人為地使某些代謝產(chǎn)物過(guò)量積累， 獲得所需要的高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)和低耗的菌種。而基因突變作為很重要的途徑之一，一直被廣泛應(yīng)用[16]。目前， 國(guó)內(nèi)微生物育種界主要采用的仍是常規(guī)的物理、生物及化學(xué)因子等誘變方法

57、使之改組。本次實(shí)驗(yàn)是通過(guò)新型誘變方法——常壓室溫等離子體（ARTP）誘變育種系統(tǒng)。</p><p>　　通過(guò)本次實(shí)驗(yàn)得出以下結(jié)論：</p><p>　?。?）從HX-3-6乳酸菌第一次誘變前的生長(zhǎng)曲線得出該菌株的對(duì)數(shù)期在3～21h，約在18h進(jìn)入對(duì)數(shù)期后期，該時(shí)間段為誘變最佳時(shí)機(jī)。經(jīng)誘變，對(duì)致死率達(dá)到90%的突變進(jìn)行篩選，最后篩選出突變菌L-120-1產(chǎn)量為5.828g/L，較出發(fā)菌株產(chǎn)量

58、提高18，84%，</p><p>　?。?）本次實(shí)驗(yàn)所測(cè)得的乳酸菌HX-3-6的生長(zhǎng)曲線和乳酸菌L-120-1的生長(zhǎng)曲線有所不同，可能是乳酸菌誘變后基因發(fā)生改變。</p><p>　?。?）本實(shí)驗(yàn)對(duì)乳酸菌菌株L-120-1進(jìn)行誘變后，得到90s-高2的突變菌株產(chǎn)GABA產(chǎn)量最高的突變菌株較原始乳酸菌菌株HX-3-6產(chǎn)量提高25.98%。</p><p>　?。?）

59、對(duì)出發(fā)乳酸菌菌株L-120-1進(jìn)行誘變處理，誘變初篩后從梯度平板上的高、中、低三個(gè)濃度中挑選單菌落進(jìn)行篩選。篩選后得到90s-高2的突變菌株的產(chǎn)量最高，較誘變前L-120-1(5，319g/L）產(chǎn)量提高16.15%。</p><p>　　由于時(shí)間的不足本次實(shí)驗(yàn)最終得到的產(chǎn)GABA的乳酸菌提高率不是太理想，建議可以在以下方面開展進(jìn)一步工作：</p><p>　　（1）對(duì)突變株進(jìn)行紫外誘變育種

60、和化學(xué)誘變育種相結(jié)合的復(fù)合育種育種，以期獲得高產(chǎn)GABA乳酸菌突變菌株。</p><p>　?。?）將誘變與高通量篩選相結(jié)合，提高篩選突變株的效率，獲得高產(chǎn)菌株。</p><p>　?。?）對(duì)誘變后獲得的高產(chǎn)菌株與基因工程相結(jié)合，探討誘變導(dǎo)致高產(chǎn)的機(jī)制與原理。</p><p><b>　　致 謝</b></p><p>

61、;　　回首大學(xué)四年的生活，充實(shí)而快樂(lè)，特別是畢業(yè)設(shè)計(jì)的順利完成給我的大學(xué)活畫上了完滿的句號(hào)。</p><p>　　本論文從課題的選擇到項(xiàng)目的最終完成，從結(jié)果分析到最終成文，XXX教授始終對(duì)我細(xì)心指導(dǎo)嚴(yán)格要求，并多次詢問(wèn)實(shí)驗(yàn)進(jìn)程，為我答疑解難，幫助我開拓研究思路，熱忱鼓勵(lì)。在完成論文的過(guò)程中，我的動(dòng)手能力、分析和解決問(wèn)題的能力，以及獨(dú)立思考的能力都得到了很大的提高。在此謹(jǐn)向薛老師致以誠(chéng)摯的謝意和崇高的敬意！<

62、/p><p>　　感謝生技專業(yè)各位專業(yè)課老師對(duì)我的悉心教導(dǎo)。正是因?yàn)橛辛诉@些專業(yè)基礎(chǔ)知識(shí)，我才能了解到實(shí)驗(yàn)的原理，并且設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方法完成實(shí)驗(yàn)。在此，謹(jǐn)向老師們表示衷心的感謝！</p><p>　　在此次畢業(yè)實(shí)驗(yàn)的過(guò)程中，特別感謝梁慧學(xué)姐及其他幾位學(xué)長(zhǎng)學(xué)姐對(duì)我的指導(dǎo)和支持，還有實(shí)驗(yàn)室的其他同學(xué)的熱心幫助，在此一并致謝！</p><p><b>　　2014年6月4

63、日</b></p><p><b>　　參考文獻(xiàn) </b></p><p>　　[1]楊勝遠(yuǎn)，陸兆新，呂風(fēng)霞，別小妹. γ-氨基丁酸的生理功能和研究開發(fā)進(jìn)展[J]. 食品科學(xué)，2008，09（04）：528-533</p><p>　　[2]溫博貴：國(guó)外醫(yī) 學(xué)參考資料(中山醫(yī)學(xué)院 )，2011，11( 05)：132-134

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69、t of physical mutation techniques in industrial microbe breeding， Biotechnol. Bull. 2 2007，15（11）： 114–118</p><p>　　[15]郭曉娜，朱永義，朱科學(xué). 生物體內(nèi)γ-氨基丁酸的研究[J]. 氨基酸和生物資源，2003，13（02）：70-72 </p><p>　　[16] 夏

70、江，梅樂(lè)和，黃俊等.產(chǎn)r-氨基丁酸的乳酸菌株篩選及誘變[J].核農(nóng)學(xué)報(bào)，2006，20(5)：379-382</p><p><b>　　附錄</b></p><p>　　本附錄中表格的表序與正文中的圖序相對(duì)應(yīng)。</p><p>　　表4-1 乳酸菌HX-3-6 所測(cè)OD600值</p><p>　　表4-2 乳酸菌HX