小硅藻培養(yǎng)過程中脂類代謝物的變化研究【畢業(yè)設計】

1、<p><b>　　本科畢業(yè)設計</b></p><p><b>　?。?0_ _屆）</b></p><p>　　小硅藻培養(yǎng)過程中脂類代謝物的變化研究</p><p>　　所在學院 </p><p>　　專業(yè)班級

2、生物技術 </p><p>　　學生姓名 學號 </p><p>　　指導教師 職稱 </p><p>　　完成日期 年 月 </p><p><b>　　目錄</b>

3、;</p><p><b>　　1 引言1</b></p><p>　　2 實驗材料和方法1</p><p>　　2.1 實驗材料1</p><p>　　2.1.1 實驗藻種1</p><p>　　2.1.2 培養(yǎng)基1</p><p>　　2.1.3 儀器和試劑

4、1</p><p>　　2.2 實驗方法2</p><p>　　2.2.1 小硅藻的培養(yǎng)2</p><p>　　2.2.2 小硅藻細胞密度的測定2</p><p>　　2.2.3 脂類代謝物的提取2</p><p>　　2.2.4 色譜和質譜條件2</p><p>　　2.2.5 數(shù)據(jù)

5、處理3</p><p><b>　　3 實驗結果3</b></p><p>　　3.1 小硅藻生長周期試驗的指紋識別4</p><p>　　3.2 小硅藻生長周期代謝指標物的定性分析6</p><p>　　3.3 小硅藻周期試驗過程中脂類代謝指標物的變化9</p><p><b&g

6、t;　　4 討論9</b></p><p><b>　　5 總結9</b></p><p>　　致謝錯誤!未定義書簽。</p><p><b>　　參考文獻10</b></p><p>　　摘要：為了研究小硅藻（Nitzschia closterium f. minutissim

7、a）在培養(yǎng)過程中脂類代謝物的變化，利用超高效液相色譜－四極桿－飛行時間質譜（UPLC-Q-TOF-MS），電噴霧電離源分別在正負離子模式下，對小硅藻對數(shù)期和穩(wěn)定期的脂類代謝物進行測定，并通過SIMCA-P軟件進行主成分分析和正交偏最小二乘法辨別分析。結果表明，從對數(shù)生長期到穩(wěn)定期，三酰甘油及溶血lyso-DGDG、lyso-SQDG均呈現(xiàn)增加的趨勢；而PC、MGDG、DGDG、SQDG、PG均呈現(xiàn)降低的趨勢。這些脂類代謝物的變化，不僅可

8、以用來判別微藻的脂類合成途徑，而且可以科學確定出脂類、能源積累的階段，從而為微藻的能源開發(fā)提供理論依據(jù)。</p><p>　　關鍵詞：小硅藻；生長周期；脂類代謝物；四極桿－飛行時間質譜；超高效液相色譜</p><p>　　Abstract: The aim of this study was to investigate how the lipid metabolites change i

9、n Nitzschia closterium f.minutissima during the growth phase. It was studied by the ultra performance liquid chromatography-quadrupole-time of flight-mass spectrometry (UPLC-Q-TOF-MS) using electron spraying ionization w

10、ith positive and negative mode, in an effort to find potential metabolite biomarkers during the growth. After the UPLC-Q-TOF analysis, principal components analysis (PCA) and orthogonal projectio</p><p>　　Ke

11、ywords: Nitzschia closterium f.minutissima; growth phase; Lipidomics; Quadrupole-time of flight-mass spectrometry; ultra performance liquid chromatography</p><p><b>　　1 引言</b></p><p>

12、;　　海洋微藻是海洋生態(tài)系統(tǒng)中最重要的自養(yǎng)生物，也是最主要初級生產(chǎn)者，在海洋生態(tài)系統(tǒng)的物質循環(huán)和能量流動中起著極其重要的作用。</p><p>　　海洋微藻作為優(yōu)良的天然餌料被廣泛應用于水產(chǎn)養(yǎng)殖，是海水仔魚、蝦蟹貝等水產(chǎn)經(jīng)濟動物幼體的主要食源，其產(chǎn)生的一些多不飽和脂肪酸（PUFA），特別是EPA，20:5（n-3）和DHA，22:6（n-3），其含</p><p>　　量直接關系到仔魚及幼

13、體的存活和生長發(fā)育[1]。海洋微藻中的小硅藻（Nitzschia closterium f. minutissima），也稱小新月菱形藻，在分類上屬于硅藻門，細胞呈紡錘形。個體小、繁殖快、脂肪含量高，環(huán)境適應能力強。小硅藻還含有高度不飽和脂肪酸EPA，可作為理想的保健食品，也可以作為甲殼類、雙殼類和仔魚的餌料從而在海水養(yǎng)殖業(yè)中占有重要地位[2]。</p><p>　　微藻的餌料價值與許多因素有關，包括細胞大小、細

14、胞壁的可消化程度和細胞內(nèi)的生化組成特別是脂類的組成和含量，尤以后者最為重要[3,4]。先前的研究認為不飽和脂肪酸的含量是影響微藻餌料價值的最主要因子，但脂類代謝物作為營養(yǎng)物質和供能物質，對養(yǎng)殖生物的生長發(fā)育同樣起決定作用[5]。植物細胞體內(nèi)含中性脂和極性脂，極性脂一般為海洋微藻的主要脂類，大部分為磷脂和糖脂；中性脂主要為三?；视停鳛橹舅岬囊环N儲存形式，在細胞分裂、能量代謝、維持膜的穩(wěn)定性、生物合成及其他許多生理過程中起作用，為主

15、要的儲存脂類[6,7]。</p><p>　　目前有研究結果表明，微藻不同生長階段（對數(shù)期和穩(wěn)定期），會造成細胞內(nèi)總脂含量和脂肪酸組成的變化[8,9]。而海洋微藻的脂類含量和組成除了決定于藻種本身的遺傳因素外[10]，還受其他環(huán)境條件，如溫度[11,12]、光照[13]，.鹽度[14]等的影響。培養(yǎng)基的種類也會對微藻的脂肪酸組成產(chǎn)生影響[15]，特別是培養(yǎng)液中氮源的影響更為顯著[16]。</p>&

16、lt;p>　　由于國內(nèi)外學者關于環(huán)境因子對微藻脂類積累影響的研究主要集中在營養(yǎng)鹽成分、光強、溫度等因素上，而生長周期內(nèi)脂類的積累，特別是極性脂積累變化的研究較少。因此本文以小硅藻為研究對象，研究其生長周期不同階段脂類代謝物的變化，從而科學確定出脂類、能源積累的階段，為小硅藻的大規(guī)模培養(yǎng)和能源開發(fā)提供理論依據(jù)。</p><p><b>　　2 實驗材料和方法</b></p>

17、<p><b>　　2.1 實驗材料</b></p><p>　　2.1.1 實驗藻種</p><p>　　小硅藻（Nitzschia closterium f.minutissima），由寧波大學海洋生物工程重點實驗室微藻室提供。</p><p><b>　　2.1.2 培養(yǎng)基</b></p>

18、<p>　　小硅藻的培養(yǎng)使用f/2培養(yǎng)液。其基本配方見表1。</p><p>　　2.1.3 儀器和試劑</p><p>　　ACQUITY超高效液相色譜系統(tǒng)，色譜柱ACQUITY UPLC BEH C8（1.7µm，100mm×2.1mm），Q-TOF Premier高分辨四極桿和飛行時間質譜儀，MassLynx 4.1數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)均為美國Waters公司產(chǎn)

19、品；超純水系統(tǒng)（法國Millipore公司）；GXZ智能型光照培養(yǎng)箱（寧波江南儀器廠）；LDZX-50FB高壓蒸汽滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）；TDLSO-2B飛鴿低速臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）；TP300超聲波清洗機（北京泰拓公司）；漩渦混合器（上海精科實業(yè)公司）；W-O系列恒溫水浴鍋、旋轉蒸發(fā)器均為上海中順生物科技公司產(chǎn)品；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵（義烏平華儀器公司）等。抗氧化劑2,6-二特丁基對甲酚（BHT，>9

20、9.9%）；色譜純氯仿、甲醇、乙腈、甲酸均為美國Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品；純水來源由超純水系統(tǒng)制備。</p><p><b>　　2.2 實驗方法</b></p><p>　　2.2.1 小硅藻的培養(yǎng)</p><p>　　用于微藻培養(yǎng)的海水均經(jīng)脫脂棉過濾、煮沸消毒，所有容器均高溫滅菌。培養(yǎng)器皿為3000mL三角燒瓶，培養(yǎng)3個平行樣。往

21、瓶中加入2000mL培養(yǎng)液（1:1000），200ml藻液，用紙蓋好瓶口，用棉繩扎緊。培養(yǎng)條件是在光照培養(yǎng)箱中，明暗周期為12h:12h；光照方式：日光燈；光照強度約2500lx；溫度為20±2℃。</p><p>　　表1 f/2培養(yǎng)液配方</p><p>　　2.2.2 小硅藻細胞密度的測定</p><p>　　每天振搖2次，每天定時取樣一次，取5.0

22、0mL充分搖勻的藻液，加入1－2滴5%（V/V）的福爾馬林溶液固定，然后取一滴藻液置于血球計數(shù)板上，在光學顯微鏡下對藻細胞進行計數(shù)。每一批次做3個平行樣，取其平均值，然后換算成相應的藻細胞密度（藻細胞密度=藻數(shù)×104個/cm3）。作培養(yǎng)時間（天）與藻細胞密度的關系圖，得到小硅藻的生長曲線（圖1）。</p><p>　　2.2.3 脂類代謝物的提取</p><p>　　取不同生長

23、階段（對數(shù)期和穩(wěn)定期）一定體積的藻液，4000－4800r/min離心10min，再用消毒淡水清洗2－3次，經(jīng)冷凍干燥，放入玻璃離心管中低溫（-4℃）保存。將干燥的藻泥采用氯仿:甲醇（v/v，1:1）提取法得到藻中的脂類代謝物。通過旋轉蒸發(fā)，干燥后充入氮氣，于-20℃貯存待用。所有溶液均加入BHT（50mg/L）。</p><p>　　2.2.4 色譜和質譜條件</p><p>　　色譜條

24、件：流動相為85乙腈/甲醇（V/V，2:1）:15異丙醇（V/V）溶液（A）和水（B），進樣1L，流速0.25mL/min，柱后1:4分流進入質譜。流動相中加入0.1％甲酸和0.05µmol/L 的甲酸鈉。采用梯度洗脫時洗脫梯度為：B從在8min內(nèi)從初始5％升至70％，在12min內(nèi)從70％升至90％，在8min內(nèi)從90％升至95％，保持14min，在1min升至100％保持3min，最后在1min內(nèi)降到5％然后平衡11min

25、。</p><p>　　質譜條件：使用電噴霧電離源（ESI）進行分析，脫溶劑的氮氣流速為400L/h，脫溶劑的溫度為250℃，離子源的溫度為120℃，錐孔反吹氮氣為0。TOF離子飛行的方式為V模式，四極桿的掃描范圍為50－1200。目標離子的精確質量數(shù)由外標物亮腦啡肽進行鎖定。正離子模式下，毛細管電離電壓3.0kV，負離子模式下，毛細管電離電壓2.6kV；取樣錐孔電壓為35－80V，碰撞室能量看分析目的不同采用5

26、－60V不等。</p><p>　　2.2.5 數(shù)據(jù)處理</p><p>　　原始數(shù)據(jù)由美國WATERS公司研發(fā)的MassLynx 4.1數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)采集，再通過MarkerLynx管理系統(tǒng)進行處理，從而建立每一樣品對應保留時間和質荷比的峰數(shù)量以及歸一化的峰強度數(shù)據(jù)庫，然后將這個數(shù)據(jù)庫導入SIMCA-P分析軟件，對數(shù)據(jù)進行正交偏最小二乘法分析（O-PLS-DA）和主成分分析（PCA）。采用

27、MassFragment分析軟件、Human Metabolome Database數(shù)據(jù)庫檢索等多種技術手段，對候選生物標記物進行結構解析。</p><p>　　圖1 3個平行樣的小硅藻生長曲線</p><p><b>　　3 實驗結果</b></p><p>　　3.1 小硅藻生長周期試驗的指紋識別</p><p>　

28、　為了使實驗結果可靠和統(tǒng)計正確，減小誤差，每個小硅藻樣品重復進樣三次。為了得到每一個樣品的信息，對樣品在正負離子模式下進行液相色譜－質譜（LC-MS）分析。每個樣品進樣數(shù)為六次，分別是電噴霧正離子模式分析三次和負離子模式分析三次。利用UPLC-Q-TOF-MS分析系統(tǒng)，使小硅藻的脂類代謝物在液相色譜柱上發(fā)生分離（圖2）。</p><p>　　圖2 小硅藻樣品的總離子流圖。A. ESI-掃描；B. ESI+掃描&l

29、t;/p><p>　　經(jīng)MarkerLynx處理，小硅藻樣品可以分別得到8398（正離子模式）、3067個（負離子模式）信號峰，將這些信號峰通過歸納處理，進行主成分分析，得到５組小硅藻樣品在正負離子模式下的PCA得分圖（圖3）。圖上每一個點代表一個樣品，每組樣品用圈隔開以方便觀察，從圖中可以直觀在看到不同生長時期小硅藻樣品的差異性[17]。</p><p>　　根據(jù)統(tǒng)計學原理，通過SIMCA-

30、P分析軟件對樣品進行正交偏最小二乘法（O-PLS-DA）分析。圖4是基于正交偏最小二乘法獲得的第一組（7天后和9天后收集的為第一組）和第二組（17天后、24天后和27天后收集的為第二組）小硅藻樣品數(shù)據(jù)分析結果的S載荷圖（S-loading plot）。在S載荷圖上，每一個點為一個數(shù)據(jù)對，其表示了該物質的質量數(shù)和保留時間。中間的橫軸表示可變量，數(shù)據(jù)對離0越遠，說明樣品的差異性越大?？v軸表示每個樣品間的相關性，數(shù)據(jù)對離0越遠，說明樣品的相關

31、性越好。所以，圖中兩端的數(shù)據(jù)對表示了樣品中可信度最高的特征離子。然后根據(jù)變異權重參數(shù)（VIP）在正負離子模式下分別提取前20個特征離子（表2）作為潛在標志物進行定性分析。</p><p>　　圖3 小硅藻前二主成分的PCA得分圖。A. 正離子掃描模式ESI+ scan；B. 負離子掃描模式ESI- scan；</p><p>　　1. 7天后收集小硅藻樣品，2. 9天后收集，3. 17天后

32、收集，4. 24天后收集，5. 27天后收集。</p><p>　　圖4 基于正偏交最小二乘法獲得的第一組和第二組小硅藻樣品的S-載荷圖。</p><p>　　A. 正離子模式下S-載荷圖；B. 負離子模式下S-載荷圖</p><p>　　表2 對第一組和第二組小硅藻樣品進行正偏交最小二乘法分析后相對第二組比較獲得的潛在生物標志物</p><p&

33、gt;　　#：第一組為小硅藻7天和9天后取樣樣品；第二組為小硅藻17天，24天和27天取樣樣品。</p><p>　　3.2小硅藻生長周期代謝指標物的定性分析</p><p>　　根據(jù)以上提取出的前20個變量離子的m/z比值的精確質量數(shù)（質量相對誤差小于5ppm）得到其可能的元素組成，在互聯(lián)網(wǎng)上提供的免費LIPID MAPS庫（http://www.lipidmaps.org），HMDB庫

34、（http://www.hmdb.ca）和METLINE庫（http://metlin.Scripps.edu）里進行搜索，與標準品的色譜行為和二級質譜數(shù)據(jù)進行比對進行最終定性。</p><p>　　對于前20個變量離子中的絕大部分離子為三酰甘油（TAG）、二酰甘油硫代糖脂（SQDG）、硫代溶血硫代糖脂（lyso-SQDG）和單半乳糖甘油二酯（MGDG），由于無法買到所有的標準品，主要根據(jù)其m/z比值的精確質量數(shù)

35、和二級質譜數(shù)據(jù)，根據(jù)脂類物質的質譜裂解規(guī)律進行最終定性。比如圖2中保留時間為34.44min、ESI+模式下m/z為825.6958代謝物離子，根據(jù)正離子掃描模式下的TIC圖中對應保留時間處的質譜（圖5），可確定出此分子對應的[M + H]+ （m/z 803.7138）、[M + Na]+ （m/z 825.6958）、[M+NH4]+ （m/z　820.6786），故此標志物的分子量為802.7060，而其 [M + H]+ 的精確

36、m/z為803.7138。誤差允許0.01Da范圍內(nèi)在HMDB庫中進行檢索，可得到8個可能的吻合物，其中有6個為三酰甘油。這些物質有著不同的?；舅峤M成，在高能量下會產(chǎn)生不同的碎片離子，所以進一步考察目標代謝物的二級質譜行為（圖6）：正離子模式下產(chǎn)生m/z 221和m/z 219，m/z 237和m/z 239，m/z 549和m/z 54</p><p>　　圖5 保留時間34.44min處的ESI-MS圖&

37、lt;/p><p>　　再舉個例子，比如圖2中保留時間為19.46min、ESI+模式下m/z 為795.4997代謝物離子，根據(jù)正、負離子掃描模式下的TIC圖中對應保留時間處的質譜（圖7），可確定出此分子對應的[M + Na]+ (m/z 795.4997)、[M-H]- (m/z 771.5066)和[M+HCOOH-H]- (m/z 817.5101)，故此標志物的分子量為772.5099。誤差允許5ppm范圍

38、內(nèi)在METLINE庫中進行檢索，可得到1個可能的吻合物（18:3/18:4 MGDG）。進一步考察目標代謝物的二級質譜行為（圖8）：正離子模式下m/z 243的存在預示此物質有一個半乳糖頭部，同時</p><p>　　并未找到405的離子，說明物質確實是MGDG[19]，負離子模式下豐度最強的為m/z251.1947和301.2126，正離子模式下豐度最強的為m/z493.2767和543.2953（為MGDG脂

39、肪?；鶊F作為羧酸的中性丟失而產(chǎn)生的離子），表明這個單半乳糖甘油二酯的兩個脂肪?；謩e為16:2和20:5，而正離子模式下m/z493.276離子信號比m/z543.2953離子信號強，根據(jù)在各碰撞能量（5-80V）碰撞下[M+Na-R1COOH]+的強度總是高于[M+Na-R2COOH]+-的強度的規(guī)律[19]，得出sn-1是20:5而sn-2位是16:2，最終可確定此代謝物為MGDG（20:5/16:2）。</p>&

40、lt;p>　　圖6 [M + Na]+ (m/z 825.6958)的ESI-MS2圖</p><p>　　圖7 保留時間19.46min處的ESI-MS圖</p><p>　　根據(jù)以上定性過程，剔除重復的信息（正負離子模式下均排在前20位的同一物質，同一離子模式不同離子化狀態(tài)的同一物質），在獲得的潛在生物標志物中，最終鑒定出2種MGDG，1種lyso-DGDG，1種PC，3種SQD

41、G，3種lyso-SQDG、2種PG、7種TAG，另外9種化合物未鑒定出。（表2）</p><p>　　圖8 [M + Na]+ (m/z 795.4997)和[M+HCOOH-H]- (m/z 817.5101)的ESI-MS2圖</p><p>　　3.3 小硅藻周期試驗過程中脂類代謝指標物的變化</p><p>　　表2中相關系數(shù)均是相對2組的結果，正值表示與

42、第二組樣品正相關即生長過程中該代謝物呈現(xiàn)增加的趨勢，而負值表示與第一組樣品正相關即生長過程中該代謝物呈現(xiàn)減少的趨勢。可見，從分布趨勢看，隨時間的增長，三酰甘油及溶血lyso-DGDG、lyso-SQDG均呈現(xiàn)增加的趨勢；而PC、MGDG、DGDG、SQDG、PG均呈現(xiàn)降低的趨勢。</p><p><b>　　4 討論</b></p><p>　　比較各光合膜脂分子?；?/p>

43、可以發(fā)現(xiàn)，所有光合膜脂分子的sn-2位均為C16的脂肪酸，此類由位于質體的原核生物合成途徑合成。同時，TAG第三條鏈主要是C16，也說明其主要是通過植物原核途徑合成的。 </p><p>　　從對數(shù)期到穩(wěn)定期，極性脂（主要是光合膜脂）含量均下降，而中性脂（TAG）的含量明顯升高，說明在這個過程中光合作用效率降低，多余的能量轉化成三酰甘油儲存起來。細胞生長過程中，后期由于營養(yǎng)物質的消耗、代謝產(chǎn)物的生成使培養(yǎng)環(huán)境不利

44、于自身生長，溶血lyso-DGDG、lyso-SQDG的增長可能與清除體內(nèi)自由基有關。</p><p><b>　　5 總結</b></p><p>　　本實驗以海洋微藻小硅藻（Nitzschia closterium f.minutissima）為研究材料，以脂類代謝物為主要的研究對象，用以上建立的微藻光合作用膜脂的LC-MS分析方法作為基本分析手段，在小硅藻生長周

45、期過程中，對小硅藻的脂類代謝物的變化規(guī)律進行研究。結果表明，從對數(shù)生長期到穩(wěn)定期，三酰甘油及溶血lyso-DGDG、lyso-SQDG均呈現(xiàn)增加的趨勢；而PC、MGDG、DGDG、SQDG、PG均呈現(xiàn)降低的趨勢。</p><p><b>　　參考文獻</b></p><p>　　[1]蔣霞敏,鄭亦周.14種微藻總脂含量和脂肪酸組成研究[J].水生生物學報,2003,2

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