雙酶法對烏賊眼中透明質酸提取率的影響【畢業(yè)設計】

1、<p><b>　　本科畢業(yè)設計</b></p><p><b>　　（20_ _屆）</b></p><p>　　雙酶法對烏賊眼中透明質酸提取率的影響</p><p>　　所在學院 </p><p>　　專業(yè)班級 食品質

2、量與安全 </p><p>　　學生姓名 學號 </p><p>　　指導教師 職稱 </p><p>　　完成日期 年 月 </p><p><b>　　目　錄 </b>

3、;</p><p><b>　　1引言1 </b></p><p>　　1.1透明質酸性質1 </p><p>　　1.2透明質酸提取現(xiàn)狀1</p><p>　　1.3本文的主要研究內(nèi)容及意義2</p><p><b>　　2材料與方法2</b></

4、p><p>　　2.1材料與設備2</p><p>　　2.1.1材料2</p><p>　　2.1.2設備2</p><p><b>　　2.2方法2</b></p><p>　　2.2.1酶活力測定2</p><p>　　2.2.2葡萄糖醛酸標準曲線制

5、作4</p><p>　　2.2.3透明質酸粗品的制備工藝5</p><p>　　2.2.4 透明質酸的純化工藝5</p><p>　　2.2.5 透明質酸含量測定 5</p><p>　　2.2.6透明質酸紫外光譜5</p><p>　　3 結果與討論5</p><p>

6、　　3.1中性蛋白酶的工藝條件5</p><p>　　3.2鏈霉菌蛋白酶酶解條件優(yōu)化5</p><p>　　3.2.1酶解時間6</p><p>　　3.2.2酶解溫度6</p><p>　　3.2.3 酶解PH 7</p><p>　　3.2.4 酶濃度8 </p><p>

7、;　　3.3酶法提取透明質酸的正交試驗8</p><p>　　3.4 透明質酸紫外光譜9</p><p><b>　　4小結11</b></p><p><b>　　致謝12</b></p><p><b>　　參考文獻13</b></p><

8、p><b>　　1</b></p><p>　　摘 要：透明質酸是生物體內(nèi)普遍存在的酸性黏多糖，具有獨特的黏彈性、生物相容性及非免疫原性，在生命科學、食行業(yè)以及醫(yī)學領域都有較為廣泛的應用。本文對烏賊眼液進行雙酶提取，首先使用4%中性蛋白酶在60°C下進行4h的酶解，然后用鏈霉菌蛋白酶進行二次酶解，再通過CTAB絡合，乙醇沉淀得到最終透明質酸。 最后通過正交實驗，優(yōu)化了鏈霉菌蛋

9、白酶提取透明質酸的最佳工藝條件，實驗結果表明，在酶用量6%，pH為7,酶解時間4h，酶解溫度為55℃時，此時透明質酸的紫外吸光度為1.1970，得到的透明質酸提取率為12.46% ，通過紫外-可見光譜對比可看出提取得到的透明質酸純度較好。</p><p>　　關鍵詞：透明質酸；提??；鏈霉菌蛋白酶；烏賊</p><p>　　Abstract：Hyaluronic acid is organi

10、sms widespread acidic sticky polysaccharide, has a unique viscoelastic, biocompatible and non-immunogenic, in life sciences, food industry and medical domain has a wide range of applications. In this paper, the two enzym

11、es extracted squid eye drops, first to conduct a neutral protease enzyme(enzyme concentration was 4% ,temperature of 60 °C, enzyme extraction time was 4h) using crude extract obtained by HA intermediate goods, then

12、a second protease enzyme Strept</p><p>　　Keywords: Hyaluronic acid; extraction; Streptomyces protease; squid </p><p><b>　　引言</b></p><p>　　1.1 透明質酸性質</p><p>

13、;　　透明質酸是一種由D-N-乙酰氨基葡萄糖和D-葡萄糖醛酸為結構單元的高分子粘多糖，由于直鏈軸上單糖之間氫鍵的作用，透明質酸分子在空間上呈剛性的螺旋柱型[1]，柱的內(nèi)側由于存在大量的羥基而產(chǎn)生強烈的親水性；同時羥基的連續(xù)定向排列，又在分子鏈上形成高度的憎水區(qū)，HA分子的親水和憎水特性，使得濃度低于1‰的HA也能形成連續(xù)的三維蜂窩狀網(wǎng)絡結構，水分子則在網(wǎng)絡內(nèi)通過極性鍵和氫鍵與HA分子相結合，使得這些水在柱內(nèi)固定不動，不易流失，HA親和吸

14、附的水分約為其本身重量的1000倍，這是其它粘多糖無法比擬的。</p><p>　　HA具有獨特的分子結構和理化性質，它在有機體內(nèi)顯示出多種重要的生理功能，具有特殊的保濕作用；分子量大的可在皮膚表面形成膜狀，起到比較強的保濕潤滑作用，而且分子量小的ＨＡ還能被皮膚吸收進入真皮層，促進人體血液循環(huán)、改善中間代謝等，從而使皮膚變得光滑、柔嫩[2]，而且透明質酸無致炎性及抗原性，是理想的“粘性手術”材料，對眼科、骨科手術

15、的完成和康復起重要作用[3]，所以被廣泛應用于化妝品、醫(yī)藥等方面。但是E. Gura[4]和T. Miyazaki*[5]等人的研究表明，透明質酸的構想受溫度、pH、外界機械剪應力以及鹽濃度的影響，因此在獲得相對分子量分布帶比較窄的的透明質酸時需要控制好各個實驗條件。 </p><p>　　1.2 透明質酸提取現(xiàn)狀</p><p>　　透明質酸廣泛分布于各種動物組織中，而且不同的動物組織中

16、得到的與細菌發(fā)酵得到得透明質酸無種屬差異[6]。目前所了解的制備透明質酸的方法主要有兩種，一種是從動物組織中提取，一種是從微生物發(fā)酵液中提取[7]。國內(nèi)大多從雞冠以及動物眼球等組織中提取透明質酸。但是動物組織提取法所得的HA的純度相對不是很高，而且生產(chǎn)效率低、成本高，其原料來源也受限制。雖然該法有很多缺陷，但它仍然是現(xiàn)今生產(chǎn)醫(yī)學用HA主要的方法[8]。</p><p>　　HA制備的方法目前主要有組織提取法、細菌

17、發(fā)酵法和人工合成法。</p><p>　　組織提取法的工藝流程比較簡單，獲得的HA分子量也較大，一般大于60萬，且其粘度高，保濕性能好。透明質酸在動物組織中的分布很廣泛，幾乎所有的動物組織中都含有一定水平透明質酸，只是含量不同而已。目前我們已從下列組織中分離出了透明質酸：結締組織、臍帶、皮膚、人血清、雞冠、關節(jié)滑液、腦、軟骨、眼玻璃體、人尿、雞胚、兔卵細胞、動脈和靜脈等，但考慮到原料中透明質酸含量的高低、數(shù)量的多

18、少和提取難易的程度等因素的影響，能夠真正投于生產(chǎn)的原料主要為雞冠、人臍帶和動物眼球，同時HA又還與硫酸軟骨素等粘多糖共存于生物組織中，這就導致了透明質酸提純難度加大，生產(chǎn)成本也比較高[9-10]。</p><p>　　姚美琴等[11]采用水提醇沉，等電點法脫蛋白質與超濾相結合的加工工藝，運用正交實驗法對提取工藝參數(shù)進行優(yōu)化，制備得到的透明質酸為白色粉末，得率為 2.96% 。 </p><p&

19、gt;　　酶法提取一般有單酶提取和雙酶提取兩種，但由于蛋白酶不能斷裂糖肽鍵及其附近的肽鍵，因此為去除生成物中較長的肽段在不改變糖鏈結構的前提下，可先采用堿提法或Gdn-HCl抽提法[12—14], 再用兩種或兩種以上的酶水解, 能有效地提高粘多糖的得率。所得的多糖提取液有的因粘稠，常常用離心法除去不溶物。郭育濤[15]，趙玉紅[16]等人用胰蛋白酶水解動物組織，得到純度較好的HA；汪建等[17]人采用粗胰蛋白酶水解雞冠，并分批次加入酶，

20、水解效果較好。此外常見的水解酶還有木瓜蛋白酶、 胃蛋白酶、和鏈霉菌蛋白酶等。</p><p>　　酶法脫蛋白效果較好，損失率低，但酶解強度不宜過大、時間不宜過長，否則易使太多多糖-蛋白質的復合物分解，造成某些多糖-蛋白質復合物特有的生理活性降低[18,19]</p><p>　　透明質酸無種屬差異，不同動物組織提取的透明質酸，在化學本質和分子結構上是一致的，只是相對分子質量（Ｍr）有差別。

21、</p><p>　　本文的主要研究內(nèi)容及意義</p><p>　　以烏賊眼球為原料提取透明質酸方面的研究在國內(nèi)未見報道，而烏賊眼睛是一類數(shù)量巨大的廢棄物，相對于其他魚眼較大，晶狀體所占體積也大。在水產(chǎn)品加工過程中產(chǎn)生大約15%-40%的下腳料，其中魚眼約占2-5%，所以如何從廢棄的烏賊眼球中提取透明質酸，進行科學的綜合利用，變廢為寶是一件非常有意義的事。本研究以烏賊魚眼為原料， 研究了烏

22、賊眼透明質酸的提取工藝，使烏賊資源得以合理開發(fā)利用，從而利于提高其加工的綜合效益及經(jīng)濟附加值，變廢為寶。</p><p>　　本實驗確定了最佳提取工藝：以透明質酸得率為指標，通過單因素和正交試驗考察了酶解時間、pH值、酶解溫度、酶用量對HA提取率的影響，并優(yōu)化了工藝參數(shù)。</p><p><b>　　2 材料與方法</b></p><p>　

23、　2.1 材料和設備</p><p><b>　　2.1.1 材料</b></p><p>　　烏賊：來自寧波莊市菜市場，清洗破碎，收集眼睛中的液體，除去泥沙、色素等沉淀后備用。 </p><p>　　中性蛋白酶（20萬u/g，南寧龐博生物工程有限公司），鏈霉菌蛋白酶（4000　u/g，北京奇松生物有限公司進口分裝），葡萄糖醛酸，其余試劑均

24、為分析純</p><p><b>　　2.1.2 設備</b></p><p>　　電子分析天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；DK-S24型電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實驗設備有限公司）；冷凍高速離心機，湖南湘儀離心機儀器有限公司；T6-新銳可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；Cary100紫外分光光度計，美國Varian公司。</p>

25、<p><b>　　2.2 方法</b></p><p>　　2.2.1 酶活力測定 [20]</p><p>　　2.2.1.1 試劑</p><p>　　福林試劑(Folin試劑)：于2000 mL磨口回流裝置內(nèi)，加入鎢酸鈉(Na2WO4·2H2O)100 g，鉬酸鈉(Na2MoO4·2H2O)25 g，

26、蒸餾水700 mL，85%磷酸50 mL，濃鹽酸100 mL，文火回流10 h。取去冷凝器，加入硫酸鋰(Li2SO4)50 g，蒸餾水50 mL，混勻，加入幾滴液體溴，再煮沸15 min，以驅逐殘溴及除去顏色，溶液應呈黃色而非綠色。若溶液仍有綠色，需要再加幾滴溴液，再煮沸除去之。冷卻后，定容至1000 mL，用細菌漏斗過濾，置于棕色瓶中保存。此溶液使用時加2倍蒸餾水稀釋。即成已稀釋的福林試劑。</p><p>　

27、　0.4 mol碳酸鈉溶液：稱取無水碳酸鈉(Na2CO3)42.4 g，定容至1000 mL。</p><p>　　0.4 mol三氯乙酸(T C A)溶液：稱取三氯乙酸(CCl3COOH) 65.4 g，定容至1000 mL。pH 7.2磷酸鹽緩沖液： 稱取磷酸二氫鈉(NaH2PO4·2H2O) 31.2 g，定容至1000 mL，即成0.2 mol溶液(A液)。稱取磷酸氫二鈉(Na2HPO4

28、3;12H2O) 71.63 g，定容至1000 mL，即成0.2 mol溶液(B液)。取A液28 mL和B液72 mL，再用蒸餾水稀釋1倍，即成0.1 mol pH 7.2的磷酸鹽緩沖液。</p><p>　　2% 酪蛋白溶液:準確稱取干酪素2 g，稱準至0.002 g，加入0.1 mol/L氫氧化鈉10 mL，在水浴中加熱使溶解(必要時用小火加熱煮沸)，然后用pH 7.2磷酸鹽緩沖液定容至100 mL即成。配

29、制后應及時使用或放入冰箱內(nèi)保存。</p><p>　　100 μg/mL酪氨酸溶液:精確稱取在105 ℃烘箱中烘至恒重的酪氨酸0.1000 g，逐步加入6 mL 1 mol/L鹽酸使溶解，用0.2 mol/L鹽酸定容至100 mL，其濃度為1000 μg/mL，再吸取此液10 mL，以0.2 mol/L鹽酸定容至100 mL，即配成100 μg/mL的酪氨酸溶液。</p><p>　　2.

30、2.1.2 標準曲線的繪制</p><p>　　分別吸取不同濃度酪氨酸1 mL，各加入0.4 mol碳酸鈉5 mL，再各加入已稀釋的福林試劑1 mL。搖勻置于水浴鍋中。40 ℃保溫發(fā)色20 min在660 nm波長測OD值。一般測三次，取平均值，同時做空白試驗。</p><p>　　所得酶活力標準曲線回歸方程為：y=0.0115x+0.0145，相關系數(shù) R=0.9987，其中，Y：吸光

31、度；X：酪氨酸濃度(ug/mL)，繪制標準曲線見圖1。</p><p>　　圖1 酪氨酸標準曲線 </p><p>　　Fig.1 Standard curve of enzyme activity</p><p>　　2.2.1.3 樣品測定</p><p>　　稱取酶粉0.100 g，加入pH 7.2磷酸鹽緩沖液定容

32、至100 mL，吸取此液5 mL，再用緩沖液稀釋至25 mL，即成5000倍的酶粉稀釋液。取樣品稀釋液1 mL，置于40 ℃水浴中預熱2 min，再各加入經(jīng)同樣預熱的酪蛋白1 mL，精確保溫10 min，時間到后，立即再各加入0.4 mol三氯乙酸2 mL，以終止反應，繼續(xù)置于水浴中保溫20 min，使殘余蛋白質沉淀后離心或過濾，然后另取濾液1 mL，再加0.4 mol碳酸鈉5 mL，已稀釋的福林試劑1 mL，搖勻，40 ℃保溫發(fā)色20

33、 min后進行光密度(OD)測定。空白試驗測定方法同上，唯在加酪蛋白之前先加0.4 mol三氯乙酸2 mL，使酶失活，再加入酪蛋白。計算方法為在40 ℃下每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸，定義為1個蛋白酶活力單位。</p><p>　　樣品蛋白酶活力單位(干基) = ×4×N×</p><p><b>　　式中：</b></p&g

34、t;<p>　　A —由樣品測得OD值，查標準曲線得相當?shù)睦野彼嵛⒖藬?shù)(或OD值×K)；</p><p>　　4 —4 mL反應液取出1 mL測定(即4倍)；</p><p>　　N —酶液稀釋的倍數(shù)；</p><p>　　10 —反應10 min；</p><p>　　W —樣品水分百分含量。</p>

35、<p>　　2.2.2 葡萄糖醛酸標準曲線制作</p><p>　　2.2.2.1 標準曲線的制作</p><p>　　精密稱取葡糖醛酸(AR)20mg，置100ml量瓶中，加水溶解至刻度，搖勻備用。精密量取標準溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5ml，分別加入10ml量瓶中，加水稀釋至刻度，得10、20、30、40和50μg/ml濃度的對照品溶液。取6只具塞刻度試管分別

36、加入硼砂硫酸液5ml，置冰浴中冷至4℃左右。然后分別取空白溶液(蒸餾水)和不同濃度的對照品溶液各1ml加入試管中，先輕輕振搖，再充分混勻，并不斷用冰浴冷卻，將試管置沸水中加熱10min，置常水中冷至室溫。加入咔唑試劑0.2ml，混勻，水浴中再加熱15min，冷至室溫。在530nm處測定吸收度Ａ，以吸收度對濃度Ｃ作圖即可繪出標準曲線,或作直線回歸數(shù)據(jù)處理,計算出吸收度和濃度的線性回歸方程:C=b+kA，b－截距，k－斜率。</p&g

37、t;<p>　　所得標準曲線回歸方程為：y=0.0130x+0.0136，相關系數(shù) R=0.9963，其中，Y：吸光度；X：葡萄糖醛酸濃度(ug/mL)，繪制標準曲線見圖2。</p><p>　　圖2 葡萄糖醛酸標準曲線</p><p>　　Fig.2 Standard curve of glucuronic acid</p><p>　　樣品的測定：

38、取待測樣品溶液 1mL，按照繪制標準曲線的方法測定吸光度。從標準曲線上查出</p><p>　　相應的葡糖醛酸濃度。按照下式計算得透明質酸得率（以干重計）： </p><p>　　透明質酸提取率（%）＝ （1）</p><p>　　2.2.2.2 樣品測定</p><p>　　取本品0.1g/L的溶液1ml，照標準曲線項下的方法測定吸收

39、度。從標準曲線上查出相應的葡糖醛酸濃度，按（1）式計算含量。</p><p>　　2.2.3 透明質酸中間品的制備工藝 </p><p>　　烏賊眼液 →鹽提→中性蛋白酶一次酶解→雙氧水脫色→乙醇沉淀→沉淀真空冷凍干燥→透明質酸中間品 </p><p>　　2.2.4 透明質酸的純化工藝</p><p>　　透明質酸中間品→溶解 →鏈霉菌

40、蛋白酶二次酶解→CTAB絡合→乙醇沉淀→沉淀真空冷凍干燥→透明質酸多糖粗品 </p><p>　　2.2.4.1 鏈霉菌蛋白酶二次酶解</p><p>　　將透明質酸中間品配置成5×10-3g/ml濃度的溶液，酶解時吸取10ml樣液置于錐形瓶中，與鏈霉菌蛋白酶在選擇的條件下充分反應，然后沸水浴酶滅活10min，離心取上清液。 </p><p>　　2.2

41、.4.2 CTAB絡合</p><p>　　在所得的上清液中,加入等體積的質量體積分數(shù)為1%的CTAB溶液,形成絮狀絡合物.靜置過夜,使絡合完全.以6000 r/min離心10 min,將沉淀溶于1.5 mol/L的NaCl溶液中,以相同條件離心除去不溶物.取上清液加3.5倍體積的95%濃度的乙醇使多糖沉淀。</p><p>　　2.2.5 透明質酸含量測定</p><

42、;p>　　葡萄糖醛酸含量采用Bitter-Muir咔唑法測定，經(jīng)換算得到樣品中HA的含量。</p><p>　　2.2.6 透明質酸紫外光譜</p><p>　　將上述純化得到的樣品溶解于水中，利用紫外分光光度計在紫外波長下掃描。</p><p><b>　　3 結果和討論</b></p><p>　　3.1

43、中性蛋白酶的工藝條件</p><p>　　本實驗在中性蛋白酶與鏈霉菌蛋白酶雙酶解技術，首先將烏賊眼液先用0.2mol/L的NaCl溶液鹽提4h，加入4%的中性蛋白酶，在60°C下酶解4h，沸水浴中滅酶10min后，離心取上清液。加雙氧水脫色后用乙醇沉淀，然后將沉淀進行冷凍干燥得到透明質酸的中間品[21]。采用中性蛋白酶一次酶解效果較好，但是提取得到的透明質酸的純度偏低。</p><p

44、>　　3.2 鏈霉菌蛋白酶酶解條件優(yōu)化</p><p>　　在中性蛋白酶酶解的基礎上使用鏈霉菌蛋白酶進行二次酶解，并對影響鏈霉菌蛋白酶提取烏賊眼中透明質酸的因素進行重點研究。</p><p>　　本實驗對鏈霉菌蛋白酶提取透明質酸的時間、溫度、pH值和酶添加量等因素進行了優(yōu)化，選取酶解時間2-10h，pH值6.5-8.5，酶解溫度30-60℃與酶用量2-10%等條件，以HA提取率為考

45、察指標進行單因素和正交實驗，確定提取的最佳工藝條件。</p><p>　　3.2.1 酶解時間 </p><p>　　在鏈霉菌菌蛋白酶用量為1%，酶解溫度45℃，自然pH的條件下，在酶解時間2-10h范圍內(nèi)浸提，比較不同酶解時間對HA提取率的影響，以選擇最佳酶解時間。結果如圖3。</p><p>　　圖3 酶解時間對透明質酸提取率的影響</p>&l

46、t;p>　　Fig.3 The influence of extraction time on the yielding rate of HA</p><p>　　圖3表明，酶解時間為4h時，透明質酸提取率最高( 11.97%)，水解時間進一步延長，透明質酸提取率反而下降。理論上講，反應時間越長，酶解越充分，HA提取率越高，而當酶濃度達到一定值時，酶促反應時間的延長并不能使提取率增加甚至會引起下降，這說明在

47、4h時間里酶解反應已經(jīng)進行的較為充分。而且鏈霉菌蛋白酶具有高度專一性，隨著水解時間的延長，蛋白酶可水解的肽鍵減少，同時蛋白酶活力以半衰期方式下降，而且時間太長可能引起糖結構變化甚至使碳環(huán)裂解，導致HA提取率下降。這在紫外吸收值中也得到了同樣的體現(xiàn)。</p><p>　　因此在酶解時間4h選定為最佳酶解時間。</p><p>　　3.2.2酶解溫度 </p><p>

48、　　在鏈霉菌菌蛋白酶用量為1%，在酶解時間為4h，自然pH的條件下，在酶解溫度30°C~60°C范圍內(nèi)浸提，比較不同酶解時間對HA提取率的影響，以選擇最佳酶解溫度。結果如圖4。</p><p>　　圖4 酶解溫度對透明質酸提取率的影響</p><p>　　Fig.4 The influence of extraction temperature on the yield

49、ing rate of HA</p><p>　　由圖5可見，當溫度達50℃，透明質酸提取率最高(12.26%)，酶解效果最好。當溫度高于50℃，透明質酸提取率隨溫度的升高而呈下降的趨勢。一是因為溫度升高，酶逐漸變性；二是因為透明質酸在溫度高的條件下會發(fā)生降解，所以反應溫度是透明質酸提取率高低的一個重要參數(shù)，酶解溫度選取50℃。 </p><p>　　3.2.3 酶解PH值 </p&

50、gt;<p>　　在鏈霉菌菌蛋白酶用量為1%，在酶解時間為4h，在酶解溫度為45℃，pH在6.5~8.5范圍內(nèi)浸提，比較不同酶解PH 對HA提取率的影響，以選擇最佳酶解pH。結果如圖5。</p><p>　　圖5　pH值對透明質酸提取率的影響</p><p>　　Fig.5 The influence of pH on the yielding rate of HA</

51、p><p>　　圖5表明，在pH 7.5左右提取率較高，說明酶解作用存在一個最適pH值，在最適范圍內(nèi)提取率相差不大，偏離此pH值，酶的空間構象就會改變，酶活力降低，甚至導致酶變性而失活。另外，酸性或堿性過強均會引起透明質酸自身分解，從而導致透明質酸的含量下降。因此在調(diào)試pH時，選擇PH7.5為最適合條件。</p><p>　　3.2.4 酶濃度 </p><p>　　

52、在酶解時間為4h，自然pH的條件下，在酶解溫度為 45°C，酶濃度2%~10% 范圍內(nèi)浸提，比較不同酶濃度下對HA提取率的影響，以選擇最佳酶濃度。結果如圖6。</p><p>　　圖6 酶用量對透明質酸提取率的影響</p><p>　　Fig.6 The influence of enzyme amount on the yielding rate of HA</p>

53、<p>　　如圖6所示，當酶濃度在2%~6%時，透明質酸的提取率一直在增加，而6%酶濃度之后，透明質酸的提取率表現(xiàn)出比較大的下降趨勢，因此6%的酶濃度作為酶解的最佳酶濃度。</p><p>　　酶添加量是影響HA提取率的重要因素，一般來說，酶濃度越大反應速率越快，HA的提取率也應該隨之增加，但是在本次試驗中，可能由于鏈霉菌蛋白酶的酶活性非常大，酶濃度在6%時達到了一種飽和狀態(tài)，過多的酶導致透明質酸化

54、學鍵的不必要斷裂而引起透明質酸含量的直接減少。 </p><p>　　3.3 酶法提取透明質酸的正交實驗</p><p>　　本試驗在單因素實驗基礎上，考察酶解時間、溫度、酶用量、酶解pH四因素對HA提取率的影響。利用L9（34）正交表作正交試驗，選取因素水平和結果見表2，方差分析見表3。</p><p>　　從表1可以看出，時間對透明質酸提取率的影響最大，其次是

55、PH值，酶濃度和溫度影響均很小，酶法提取的最適工藝為: A2B1C2D3　，即鏈霉菌蛋白酶酶用量6%，pH為7，酶解時間4h，酶解溫度為55℃時，此時透明質酸的紫外吸光度為1.1970，得到的透明質酸提取率為12.46% 。</p><p>　　從表2的方差分析可以看出，時間對透明質酸提取率有顯著的影響，加酶量、pH值和酶解溫度對透明質酸提取率無顯著影響。</p><p>　　表1 正交

56、實驗結果</p><p>　　Tab.1 Result of the orthogonal experiment</p><p>　　表2 正交實驗方差分析表</p><p>　　Tab.2 The result of analysis variance</p><p><b>　　注：＊為具有顯著性</b><

57、;/p><p>　　3.4 透明質酸紫外光譜圖</p><p>　　圖9中的（a）圖為烏賊眼液經(jīng)過中性蛋白酶一次酶解后經(jīng)等電點去蛋白后得到的透明質酸中間品稀釋25倍后的測量得到的紫外-可見光譜圖，峰出在205nm處，且其在260nm和280nm處有很明顯的核酸和蛋白質的吸收峰。圖（b）鏈霉菌蛋白酶二次酶解后稀釋25倍 測量得到的紫外可-見光譜圖，峰出在196處，與文獻中所描述的透明質酸純品的

58、出峰點相同，且其雜質峰也明顯變小。圖（c）是二次酶解后經(jīng)過CTAB絡合和乙醇沉淀后的HA的紫外-可見光譜圖，圖中可看出雜質峰幾乎已經(jīng)消失。</p><p>　　由此可得，鏈霉菌蛋白酶的二次酶解對于透明質酸純度有很大的影響，并且提純效果較好。</p><p>　?。╝） 經(jīng)過中性蛋白酶酶解得到的透明質酸中間品的紫外-可見光譜</p><p>　　(b) 中間品經(jīng)過鏈

59、霉菌蛋白酶二次酶解后得到得紫外-可見光譜</p><p>　　(c) 二次酶解后經(jīng)CTAB絡合和醇沉后的HA紫外-可見光譜</p><p>　　圖9 透明質酸的紫外-可見光譜</p><p>　　Fig .9 Ultraviolet spectra of hyaluronic acid</p><p><b>　　4 小結&l

60、t;/b></p><p>　　本實驗通過單因素和正交試驗研究了酶解時間、pH值、酶解溫度和加酶量對透明質酸提取率的影響，結果表明，采用中性蛋白酶一次酶解時的最佳工藝條件為：酶解時間為4h，酶解溫度60℃，加酶量為4%，PH為原液PH 6.6；采用鏈霉菌蛋白酶提取透明質酸的最適工藝條件為：酶解時間為4h，酶解溫度50℃，加酶量為6%，酶解PH 7.5。在此條件下，得到的透明質酸粗品為淺黃色無定形粉末，均無臭

61、，無味，提取率為14.10%，且樣品分子量及純度較高，有很大的發(fā)展前景。 </p><p>　　利用紫外-可見光譜分析，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過二次酶解后的HA純度增加，在260nm和280nm處核酸和蛋白質的特征吸收峰明顯變小。若進行進一步的處理可以使得透明質酸不含蛋白質和核酸雜質。 參考文獻 </p><p>　　[1] Evered D,Whelan J,eds.The biology of h

62、yaluronan,ciba foundation symposium 143[M].John Wiley＆Sons,1989:6-15.</p><p>　　[2] 張紅霞，徐三魁．程寶珠等．提取法制備透明質酸的研究[J]．鄭州工業(yè)高等專科學校學報，2002，</p><p><b>　　18（3）：6．</b></p><p>　　[3]

63、 張彬，周武．羊眼透明質酸的制備[J]．食品科技，2004，1．</p><p>　　[4] E. Gura,* M. Hiickel & P.-J. Miller．Specific degradation of rheological hyaluronic acid and its properties [J]．Polymer Degradarion and　Srability ，1998：297-

64、 302.</p><p>　　[5] Miyazaki T，Yomota C，Okada S．Ultrasonic depolymerization of hyaluronic acid[J]．Polym Degrad Stab,2001,74:77-85.</p><p>　　[6] 羅瑞明．透明質酸(HA)的國內(nèi)外研究現(xiàn)狀[J].．寧夏農(nóng)學院學報，2001，22（1）：62～64．

65、</p><p>　　[7] 潘虹梅．透明質酸的研究現(xiàn)狀綜述[J]．四川食品與發(fā)酵，2003，1（5）：6～9．</p><p>　　[8] 朱廣平，方煜平．透明質酸制備方法及應用研究的進展[J]．中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，1996，2（8），382～384．</p><p>　　[9] 陳忠杰，郭愛玲．透明質酸的應用及生產(chǎn)[J]．河南化工，2007，24(7)：48-49

66、．</p><p>　　[10] 張照明，馮強，高玲玲．透明質酸的產(chǎn)需情況及市場分析[J]．精細與專用化妝品，2007，15(9)：24-27．</p><p>　　[11] 姚美琴．魷魚眼透明質酸的提取工藝研究[J]．食品科技，2009，34（5）：241～244．</p><p>　　[12] Ricardo P Vieira,Cristiana Pedrosa

67、,Paulo A.S Mourao,et al.Extensive heterogeneity of proteoglycans bearing fucose- branched chondroitin sulfate extraced from the connective tissue of sea cucumber[J].J Biol.Chem,1993,( 32) :2254- 2262.</p><p>

68、;　　[13] 鄭艾初，陳健等．糙海參酸性粘多糖的提取純化工藝探討[J]．現(xiàn)代食品科技，2007，23( 5)：65- 67．</p><p>　　[14] 羅紅宇，高鵬等．赤魟軟骨粘多糖的制備[J]．中國海洋藥物雜志，2005，24( 4)：14-17．</p><p>　　[15] 郭玉濤，陳斌，江元汝等．從牛眼玻璃體中分離純化透明質酸的新方法[J]．精細化工，2008，25(3)：2

69、46-250．</p><p>　　[16] 趙玉紅，韓琳琳，遲玉杰．酶法提取雞蛋殼膜中透明質酸的研究[J]．食品研究與開發(fā)，2008，29（1）：40～43．</p><p>　　[17] 汪建，汪清，謝鎮(zhèn)．酶解條件控制對透明質酸工業(yè)化提取的影響[J]．2010，41（1）：20～22．</p><p>　　[18] 劉成梅，萬茵，涂宗財?shù)龋俸隙嗵敲摰鞍追椒ǖ难?/p>

70、究[J]．食品科學，2002，23(1)：89-90．</p><p>　　[19] 沈敏，馮睿，劉貝貝等．堿提菜籽多糖脫蛋白方法的研究[J]．食品科技，2006，9：273-275．</p><p>　　[20] 魏宜秦．應用正交試驗選擇中性蛋白酶活力測定最佳條件[J]．山東省藥品檢驗所，2010，40-46．</p><p>　　[21] 葉菊芳．酶法提取烏賊眼