發(fā)酵制備腺苷甲硫氨酸及其對(duì)凡納濱對(duì)蝦的應(yīng)激保護(hù).pdf

1、S－腺苷甲硫氨酸(s-adenosyl－L－methionine,簡(jiǎn)稱SAM),是一種存在于所有活細(xì)胞中的重要代謝中間體,在生物體的生理代謝中具有細(xì)胞膜保護(hù)功能和抗氧化作用。本文主要研究SAM高密度發(fā)酵培養(yǎng)工藝和檢測(cè)方法,同時(shí)還研究了它對(duì)凡納濱對(duì)蝦的應(yīng)激保護(hù)。結(jié)果如下:
　　 通過紙層析法、高效液相色譜檢測(cè)法定性定量分析檢測(cè)利用釀酒酵母發(fā)酵生產(chǎn)的SAM,得到發(fā)酵液中SAM的含量為0.35g/L.
　　 通過單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)發(fā)

2、酵工藝進(jìn)行優(yōu)化,得到最佳的發(fā)酵培養(yǎng)基為(g/l):KH2PO42,ZnSO4·7H2O0.1,MgSO4·7H2O0.1 K2HPO41,(NH4)SO44,檸檬酸三鈉5,MnSO40.3,CaCl20.1,葡萄糖30,L-蛋氨酸3,酵母浸出物1。最佳發(fā)酵條件:pH=5.5,搖床轉(zhuǎn)速為160r/min,溫度為28℃,裝液量為25ml/250ml,接種量為10％,經(jīng)過優(yōu)化SAM的發(fā)酵量由0.35g/L提高到0.904g/L。
　　

3、 把由于捕撈和運(yùn)輸處于應(yīng)激狀態(tài)的凡納濱對(duì)蝦隨機(jī)分為七組,一個(gè)為陰性對(duì)照組,三個(gè)實(shí)驗(yàn)組,三個(gè)陽性對(duì)照組。陰性對(duì)照組注射滅菌雙蒸水,實(shí)驗(yàn)組分別注射濃度1mg/ml、0.5mg/ml、0.1mg/ml的SAM注射液,于30h小時(shí)內(nèi)記錄對(duì)蝦數(shù)量并于5h,9h,12h,24h,30h時(shí)間點(diǎn)測(cè)定其免疫指標(biāo)的變化。陽性對(duì)照組養(yǎng)殖兩周,應(yīng)激消失后,也分別注射濃度1mg/ml、0.5mg/ml、0.1mg/ml的SAM,記錄并觀察其存活數(shù)。結(jié)果如下,陰性

4、對(duì)照組的死亡率最高,達(dá)到20％,陽性對(duì)照組沒有死亡,死亡率為0。凡納濱對(duì)蝦死亡率:陰性對(duì)照組>實(shí)驗(yàn)組2>實(shí)驗(yàn)組1>實(shí)驗(yàn)組3>陽性對(duì)照組,結(jié)果顯示注射SAM降低了應(yīng)激凡納濱對(duì)蝦的死亡率。比較實(shí)驗(yàn)組與陰性塒照組,凡納濱對(duì)蝦血淋巴中的NOS、PO、血藍(lán)蛋白、血細(xì)胞數(shù)量等免疫指標(biāo)都表現(xiàn)了顯著差異(P<0.05)。陰性對(duì)照組血細(xì)胞數(shù)量呈下降趨勢(shì),且在每個(gè)采樣時(shí)間點(diǎn)差異顯著(P<0.05)。除5h之外,其余采樣時(shí)間點(diǎn)陰性對(duì)照組血細(xì)胞數(shù)量與實(shí)驗(yàn)組差異

5、顯著(P<0.05),并且均低于實(shí)驗(yàn)組。注射SAM以后,凡納濱對(duì)蝦血液中血細(xì)胞數(shù)量且呈先上升再下降的趨勢(shì),在12h時(shí),數(shù)量達(dá)到峰值,且各組之間的差異顯著(P<0.05)。注射SAM的實(shí)驗(yàn)組凡納濱對(duì)蝦,血藍(lán)蛋白呈先上升再下降的趨勢(shì),在12h的時(shí)間點(diǎn)值最大,且各組之間差異顯著(P<0.05)。陰性對(duì)照組血藍(lán)蛋白呈上升趨勢(shì),在各個(gè)采樣時(shí)間點(diǎn)差異顯著(P<0.05),且高于任何一個(gè)實(shí)驗(yàn)組,實(shí)驗(yàn)組之間差異也顯著(P<0.05)。凡納濱對(duì)蝦注射SA

6、M以后血液中NOS呈先上升后下降的趨勢(shì),每一個(gè)采樣時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組NOS都低于陰性對(duì)照組,且陰性對(duì)照組之間的差異都顯著(P<0.05),實(shí)驗(yàn)組2除9h外,與其他實(shí)驗(yàn)組差異顯著(P<0.05)。陰性對(duì)照組的NOS呈上升的趨勢(shì),24h小時(shí)前每個(gè)采樣時(shí)間點(diǎn)差異都顯著(P<0.05)。注射SAM的兒納濱對(duì)蝦PO呈先上升再下降的趨勢(shì),在12h達(dá)到最高值(P<0.05),且各組間差異最顯著。陰性對(duì)照組的PO呈下降趨勢(shì),在各采樣時(shí)間點(diǎn)差異顯著(P<0.0

7、5),且與各實(shí)驗(yàn)組之間差異也顯著(P<0.05),說明注射SAM顯著影響凡納濱對(duì)蝦體內(nèi)的PO值,即顯著影響凡納濱對(duì)蝦的免疫指標(biāo),通過比較實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的死亡率及各免疫指標(biāo)變化趨勢(shì)的不同,得出SAM可以抗捕撈和運(yùn)輸應(yīng)激。
　　 把凡納濱對(duì)蝦(白斑病毒攜帶者)隨機(jī)分為七組,養(yǎng)殖鹽度為25,設(shè)一個(gè)陽性對(duì)照組,三個(gè)實(shí)驗(yàn)組,三個(gè)陰性對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組注射濃度為0.5mg/mLSAM,陰性對(duì)照組注射滅菌雙蒸水,實(shí)驗(yàn)時(shí)將對(duì)蝦從鹽度為25海水中移到

8、鹽度為15,10,5的海水中,于72h內(nèi)記錄其死亡數(shù)并于10h,24h,36h,48h,72h時(shí)間點(diǎn)測(cè)定其免疫指標(biāo)的變化,以此為依據(jù)判斷SAM是否對(duì)凡納濱對(duì)蝦鹽度應(yīng)激有保護(hù)作用。陽性對(duì)照組注射濃度為0.5mg/mLSAM,不參加鹽度應(yīng)激實(shí)驗(yàn),于72h內(nèi)記錄死亡數(shù)。結(jié)果如下,陰性對(duì)照組1的死亡率最高,達(dá)到50％,陽性對(duì)照組沒有死亡,死亡率為0。對(duì)蝦死亡率:陰性對(duì)照組1>陰性對(duì)照組2>陰性對(duì)照組3；實(shí)驗(yàn)組1>實(shí)驗(yàn)組2>實(shí)驗(yàn)組3;陰性對(duì)照組1

9、>實(shí)驗(yàn)組1,陰性對(duì)照組2>實(shí)驗(yàn)組2,陰性對(duì)照組3>實(shí)驗(yàn)組3,SAM降低了凡納濱對(duì)蝦的死亡率。比較實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照組對(duì)蝦血淋巴中的NOS、血藍(lán)蛋白、PO值、血細(xì)胞數(shù)量等免疫指標(biāo),結(jié)果顯示差異顯著(P<0.05)。對(duì)照組凡納濱對(duì)蝦的血細(xì)胞數(shù)量明顯低于實(shí)驗(yàn)組(P<0.05),且呈下降趨勢(shì)。實(shí)驗(yàn)組的血細(xì)胞數(shù)量0～10h呈上升趨勢(shì)(P<0.05),10～48h之間,血細(xì)胞數(shù)量逐漸下降的趨勢(shì),并且隨著時(shí)間變化與同時(shí)間點(diǎn)的陰性對(duì)照組血細(xì)胞數(shù)量有顯著性

10、差異(P<0.05),48h后,血細(xì)胞數(shù)量趨于穩(wěn)定,且高于陰性對(duì)照組。陰性對(duì)照組的NOS值呈先升高后降低的趨勢(shì),12h達(dá)到最高,明顯高于實(shí)驗(yàn)組,且與實(shí)驗(yàn)組的差異顯著(P<0.05),24～48h開始下降,48h后趨于穩(wěn)定(P>0.05),且明顯低于實(shí)驗(yàn)前。實(shí)驗(yàn)組凡納濱對(duì)蝦血液的NOS值0～24h呈下降趨勢(shì),24～48h呈上升趨勢(shì),48小時(shí)后NOS值趨于穩(wěn)定,并且隨著時(shí)間變化與同時(shí)間點(diǎn)的陰性對(duì)照組NOS值有顯著性差異(P<0.05)。陰性

11、對(duì)照組的血藍(lán)蛋白含量在0～24h明顯高于對(duì)應(yīng)的實(shí)驗(yàn)組,36～72h均明顯低于實(shí)驗(yàn)組。陰性對(duì)照組的血藍(lán)蛋白含量0～10h先顯著上升(P<0.05),10h后持續(xù)下降,并且逐漸向?qū)嶒?yàn)前的含量靠近；實(shí)驗(yàn)組凡納濱對(duì)蝦的血藍(lán)蛋白含量0～36h呈上升趨勢(shì)(P<0.05),36h后,血藍(lán)蛋白有緩慢的下降趨勢(shì),并且隨著時(shí)間變化與同時(shí)間點(diǎn)的對(duì)照組差異顯著(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)組凡納濱對(duì)蝦的PO值呈先上升后下降的趨勢(shì),在24h時(shí)達(dá)到峰值,且各實(shí)驗(yàn)組之間差異