黑楊三倍體速生性狀形成的分子機(jī)制研究.pdf

1、楊樹是重要的經(jīng)濟(jì)、生態(tài)樹種，也是我國防護(hù)林的主要栽培樹種。在育種工作中發(fā)現(xiàn)，多個天然加倍的三倍體楊樹，其性狀優(yōu)良，生長速率、抗性和材質(zhì)等指標(biāo)都超越二倍體，但由于林木的遺傳背景復(fù)雜，目前對三倍體速生性狀形成的分子機(jī)理研究較少。本研究以黑楊二倍體和三倍體為材料，利用MSAP技術(shù)、基因芯片、小RNA測序等手段，從基因表達(dá)水平、DNA甲基化水平和miRNA表達(dá)水平綜合分析黑楊三倍體速生性狀形成的相關(guān)分子機(jī)理。主要結(jié)果如下:
　　1.MSA

2、P分析，發(fā)現(xiàn)黑楊三倍體不同發(fā)育時期（頂芽，幼葉及成熟葉片）的甲基化動態(tài)變化與二倍體顯著不同，三倍體CHG甲基化從3.23％升高到5.83％，CG甲基化從21.31％降到14.41％，后升高到19.28％。其中CHG甲基化三倍體顯著高于二倍體。分別參與CG甲基化的MET1和CHG甲基化的CMT，及建立甲基化的DRM在二倍體和三倍體間表達(dá)量差異顯著，并且在三倍體葉片發(fā)育不同時期，MTase的表達(dá)量變化與其相應(yīng)控制DNA甲基化模式變化基本吻合

3、。21條甲基化差異片段測序發(fā)現(xiàn)18條甲基化差異片段位于基因編碼區(qū)。而且頂芽，幼葉的DNA甲基化水平與表達(dá)下調(diào)基因數(shù)間存在顯著相關(guān)性，這說明DNA甲基化參與了黑楊三倍體化后的基因表達(dá)調(diào)控，CG和CHG甲基化可能參與不同的調(diào)控機(jī)制，CG甲基化參與維持基因組的穩(wěn)定，CHG甲基化參與特定基因的表達(dá)調(diào)控。
　　2.利用楊樹基因芯片分析黑楊三倍體和二倍體的葉片基因表達(dá)差異，共分析到表現(xiàn)上調(diào)的轉(zhuǎn)錄本1564個，表現(xiàn)下調(diào)的轉(zhuǎn)錄本2015個，GO分

4、類分析發(fā)現(xiàn)151個上調(diào)基因分類，94個下調(diào)基因分類。上調(diào)基因主要參與生長素、油菜素內(nèi)酯合成代謝，碳氮循環(huán)代謝和細(xì)胞壁合成代謝。下調(diào)基因主要與核酸代謝有關(guān)。初步表明黑楊三倍體基因表達(dá)受倍性變化的影響，其速生性狀形成與基因表達(dá)變化有關(guān)。
　　3.利用NimbleGene楊樹12×135K基因表達(dá)譜芯片，首次全面分析黑楊三倍體、二倍體的頂端分生組織，幼葉，木質(zhì)莖和木質(zhì)根的基因表達(dá)變化，48276個基因中共檢測到約2.1萬個基因成表達(dá)狀態(tài)

5、，各組織表達(dá)基因數(shù)接近，但發(fā)現(xiàn)部分基因的空間表達(dá)位置發(fā)生變化。在各組織中檢測到數(shù)量不等的差異表達(dá)基因，莖中差異基因最多，上調(diào)基因2307個，下調(diào)基因2155個，并且其中特異性在莖中升高和降低的基因?yàn)?125個和768個。
　　4.芯片結(jié)果GO分類分析顯示，黑楊三倍體頂芽中生長發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)，生長素、細(xì)胞壁合成旺盛;幼葉生長素動態(tài)平衡、細(xì)胞壁合成基因表達(dá)同樣旺盛;莖中富集了大量生物量調(diào)控基因，細(xì)胞壁各組分合成、修飾、加厚、沉積

6、等相關(guān)過程的基因也表達(dá)上調(diào);根中發(fā)現(xiàn)根發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)。組織間差異表達(dá)基因分析發(fā)現(xiàn)，頂芽、幼葉生長素相關(guān)基因表達(dá)活躍，頂芽、幼葉、莖中細(xì)胞壁合成相關(guān)代謝活躍，葉片、莖、根中PCD過程和防御反應(yīng)基因活躍。這些分析顯示了黑楊三倍體速生優(yōu)勢形成的基因表達(dá)基礎(chǔ)，尤其是莖中大規(guī)模的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子相關(guān)基因的表達(dá)變化可能與莖的快速生長有關(guān)。
　　5.黑楊三倍體莖中檢測到促進(jìn)莖伸長的，BRs信號通路轉(zhuǎn)錄因子BES1表達(dá)量升高，及其相關(guān)信號通路上

7、游受體和相關(guān)激酶表達(dá)上調(diào)，表明黑楊三倍體莖快速發(fā)育主要與BRs信號通路的激活有關(guān)，同時黑楊多個組織發(fā)育的PCD過程也與BRs有關(guān)，因此，推測黑楊三倍體各組織的基因表達(dá)變化主要與生長素和BRs信號通路的激活有關(guān)。
　　6.利用Solexa測序技術(shù)，首次分析了黑楊三倍體和二倍體的小RNA的特征，發(fā)現(xiàn)小RNA、已知植物miRNA前體聚類結(jié)果和楊樹已知miRNA前體結(jié)果，黑楊三倍體均顯著多于二倍體，其中參與甲基化指導(dǎo)的24 nt的sRNA

8、豐度最高。與已知miRbase比對，黑楊中共發(fā)現(xiàn)773條miRNA與已知miRNA前體有聚類結(jié)果。表明，黑楊三倍體受基因組變化的影響產(chǎn)生了大量的sRNA，其中包括siRNA和miRNA，siRNA的大量激活可能與黑楊三倍體的DNA甲基化水平的變化有關(guān)，而miRNA的表達(dá)量變化則參與基因的表達(dá)調(diào)控。
　　7.分析了29個楊樹已知miRNA，在黑楊二倍體和三倍體的葉片和莖發(fā)育的5個時期的表達(dá)量變化，發(fā)現(xiàn)三倍體葉片發(fā)育前期大部分miRN

9、A的表達(dá)量低于同期二倍體，而后期表達(dá)量升高;莖中幾乎所有miRNA在各個發(fā)育時期表達(dá)量均高于同期二倍體，這可能是黑楊莖中大規(guī)模轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)變化的促發(fā)因素。在黑楊三倍體和二倍體中預(yù)測了8個新miRNA，通過前體克隆表達(dá)分析等手段最終確定4個黑楊新miRNA，預(yù)測了miRNA的靶基因，首次在楊樹中發(fā)現(xiàn)pec-miR3x-2的靶基因?yàn)榭刂苨RNA合成的RNA聚合酶Ⅳ的亞基，其表達(dá)量的變化與miRNA成反比。分析表明，miRNA確實(shí)在黑楊三倍體

10、的發(fā)育中呈現(xiàn)不同于二倍體的變化規(guī)律，推測這些miRNA的差異表達(dá)直接影響了生長素和BRs等相關(guān)信號通路基因的表達(dá)。
　　8.在黑楊葉片的芯片分析中分離克隆了7個高表達(dá)基因和調(diào)控相關(guān)基因，構(gòu)建了pRI101-PtSIP3,pRI101-PtISPS,pRI101-PtAIM1,pBI121-PtGDSL,pBI121-PtClpC1，pRI101-Pt674共6個表達(dá)載體，除Pt674未獲得轉(zhuǎn)基因擬南芥，其余5個楊樹基因均轉(zhuǎn)入擬南芥

11、，目前為止，Ptsip3的轉(zhuǎn)基因擬南芥中觀察到顯著表型變化，過表達(dá)Ptsip3在擬南芥中抑制胚和果莢發(fā)育、促進(jìn)根的快速生長。推測該基因在黑楊三倍體中的表達(dá)升高，可能會參與黑楊三倍體的營養(yǎng)生長期的調(diào)控并促進(jìn)根的發(fā)育。
　　結(jié)合前期對黑楊二倍體和三倍體的基因組結(jié)構(gòu)、DNA甲基化分析，不同組織的基因表達(dá)分析、sRNA測序和miRNA表達(dá)分析的結(jié)果，認(rèn)為黑楊三倍體基因組結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生大規(guī)模的改變，而黑楊速生性狀形成的直接原因是生長素、BRs