家蠶抗菌免疫信號通路相關(guān)因子的研究.pdf

1、昆蟲是地球上數(shù)量最龐大種類最多的動物群體，目前已知的昆蟲種類有100多萬種，近年來的研究表明，地球上昆蟲的實際種數(shù)可能達(dá)到1000萬種，約占全球生物種數(shù)的一半，在生態(tài)系統(tǒng)中占重要地位。在長期的進化歷程中，為了克服各種不良的環(huán)境條件，抵御病源微生物的感染和寄生，昆蟲進化出了一套高效的先天性免疫系統(tǒng)。昆蟲的先天性免疫系統(tǒng)主要分為體液免疫和細(xì)胞免疫。體液免疫主要通過血淋巴的黑化作用和抗菌肽分泌實現(xiàn)。其中，抗菌肽主要由脂肪體、血細(xì)胞以及其他組織

2、由于細(xì)菌感染激發(fā)合成，并通過Toll和immunedeficiency(IMD)信號通路的調(diào)控實現(xiàn)抗菌功能。
　　雖然家蠶的抗菌免疫通路因子研究主要參考果蠅的研究，而且果蠅參與Toll和IMD信號通路的蛋白在家蠶中大多都能找到對應(yīng)的同源蛋白，但是家蠶與果蠅的免疫抗菌通路對外源菌的識別和通路激活機制并不相同，這也導(dǎo)致了在受到外源菌感染后，家蠶抗菌肽的激活表達(dá)方式可能與果蠅存在差異。此外，保幼激素(JH)能促進果蠅部分抗菌肽表達(dá)，但在

3、家蠶則抑制這些AMP基因的表達(dá);而蛻皮激素(20E)抑制果蠅抗菌肽的表達(dá)，但在家蠶中卻誘導(dǎo)抗菌肽表達(dá)。
　　本論文在分析比較家蠶EST和基因組數(shù)據(jù)庫中Toll及IMD信號通路相關(guān)因子與哺乳動物Toll-like Receptor(TLR)信號通路、Tumor necrosis factorα(TNF-α)、果蠅Toll及IMD信號通路同源因子同源性的基礎(chǔ)上，利用RT-PCR、熒光定量PCR等技術(shù)對家蠶中部分基因進行了研究，具體研究

4、結(jié)果如下:
　　1.我們對BmSmt3、BmRelA、CecorpinB1進行了金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)實驗，并對24小時內(nèi)這些基因表達(dá)量變化進行qRT-PCR檢測，在分析比對先前實驗室研究之后，我們發(fā)現(xiàn)同樣是Lys型肽聚糖的藤黃微球菌和金黃色葡萄球菌激活BmSmt3和BmRelA的表達(dá)時，BmSmt3與BmRelA的表達(dá)變化趨勢具有相似性，我們推測革蘭氏陽性菌激發(fā)Toll信號通路時，可能會造成BmRelA與BmSmt3的同步表達(dá)。

5、r>　　2.為了驗證以上推測，我們采用具備革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁，但是肽聚糖類型為DAP型的枯草芽孢桿菌作為誘導(dǎo)菌。在同樣免疫實驗并檢測BmSmt3、BmRelA、CecorpinB1表達(dá)變化之后，我們發(fā)現(xiàn)，即便肽聚糖識別位點類型不同，革蘭氏陽性菌仍然可以激活Toll信號通路，且表現(xiàn)為BmRelA和BmSmt3的同步表達(dá)。
　　3.為了進一步驗證細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)不同而非肽聚糖類型不同是導(dǎo)致Toll信號通路激活的主要原因，我們換用DAP型肽聚

6、糖但是卻是革蘭氏陰性菌的大腸桿菌作為誘導(dǎo)菌。結(jié)果表明，大腸桿菌未能誘導(dǎo)BmSmt3與BmRelA的表達(dá)。CecorpinB1在大腸桿菌誘導(dǎo)之后的表達(dá)很可能是通過IMD因子BmRelish1的調(diào)控實現(xiàn)的。
　　4.為了探究BmSmt3、BmRelA、CecorpinB1在真菌和細(xì)菌誘導(dǎo)之后的差異，我們換用白僵菌作為誘導(dǎo)菌。通過對免疫實驗的結(jié)果進行分析后，我們發(fā)現(xiàn)，雖然白僵菌的誘導(dǎo)上調(diào)了BmSmt3和BmRelA表達(dá)，且變化幅度類似，

7、但是對CecorpinB1誘導(dǎo)效果卻遠(yuǎn)高于細(xì)菌。這說明，白僵菌感染家蠶后，抗菌肽的表達(dá)很可能得到了Toll及IMD信號通路協(xié)同調(diào)節(jié)作用。
　　5.我們首次在家蠶中鑒定出家蠶保幼激素酯酶結(jié)合蛋白（Bombyx morijuvenile hormone esterase binding protein，BmJHEBP），通過數(shù)據(jù)檢索、電子克隆、RT-PCR等方法，克隆了家蠶BmJHEBP基因。BmJHEBP全長序列由963bp組成，5

8、’端UTR和3’端UTR分別為84bp和147bp，ORF長為732bp，編碼243個氨基酸。利用生物信息學(xué)方法分析氨基酸序列的結(jié)構(gòu)與功能信息，我們發(fā)現(xiàn)BmJHEBP氨基酸序列包含有N-端線粒體信號肽序列（1-43位氨基酸）、C-端含有一個類Tim44結(jié)構(gòu)域（86-151位氨基酸）。對BmJHEBP基因組織特異性及時間特異性表達(dá)檢測結(jié)果顯示:BmJHEBP的表達(dá)在蛻皮期較高，在預(yù)蛹期降到最低，與JHE的表達(dá)及JHIII和20E表達(dá)的相吻