豬MHCⅡ類(lèi)反式激活因子CIITA基因2個(gè)突變體的鑒定及其多克隆抗體的制備.pdf

1、豬瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)是黃病毒科瘟病毒屬的一個(gè)成員，所引起的豬瘟是一種高度傳染性和致死性的疾病。近年的研究表明，豬瘟病毒在免疫豬的扁桃體、淋巴結(jié)和睪丸等多個(gè)器官持續(xù)性感染，豬瘟病毒在宿主體內(nèi)的持續(xù)性感染是該病反復(fù)發(fā)作難以根絕的主要原因。
　　 MHCⅡ類(lèi)反式激活因子(Major Histocompatibility ClassⅡTransactivator，CIITA)，是一

2、個(gè)重要的共激活因子，其主要作用是通過(guò)蛋白的羧基端與結(jié)合到MHCⅡ類(lèi)基因啟動(dòng)子上的多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子相互作用，成為這些轉(zhuǎn)錄因子的支架，共同發(fā)揮對(duì)MHCⅡ類(lèi)分子表達(dá)的調(diào)控作用。
　　 本實(shí)驗(yàn)室之前的研究結(jié)果表明，在豬瘟病毒感染的豬外周血淋巴細(xì)胞和體外培養(yǎng)的PK-15細(xì)胞中，主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ(MaiorHistocompatibility ClassⅡ，MHCⅡ)的表達(dá)水平均出現(xiàn)明顯下調(diào)。CIITA是調(diào)節(jié)MHCⅡ表達(dá)的關(guān)鍵性分子，本研

3、究的目的在于克隆豬CIITA基因，制備抗CⅡTA蛋白的多克隆抗體，使用制備的多克隆抗體檢測(cè)真核轉(zhuǎn)染的CⅡTA蛋白在PK-15細(xì)胞中的表達(dá)，探索CIITA蛋白的表達(dá)以及隨后的MHCⅡ的表達(dá)與豬瘟病毒感染的關(guān)系，為進(jìn)一步探索豬瘟病毒持續(xù)性感染的機(jī)制打下基礎(chǔ)。
　　 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)分離成年長(zhǎng)白豬外周血淋巴細(xì)胞并抽提總RNA，RT-PCR擴(kuò)增豬的CⅡTA基因，對(duì)擴(kuò)增得到的豬CⅡTA基因的測(cè)序分析表明，我們獲得了3條豬CIITA基因的序列，分

4、別命名為CⅡTA4、CⅡTA8和CⅡTA-N，其中，CⅡTA4基因與參考基因(登錄號(hào)為AY084053.1)的核苷酸序列的同源性達(dá)到99.4％，氨基酸同源性為98.6％；序列比對(duì)時(shí)我們還發(fā)現(xiàn)，CIITA8基因的核苷酸序列在其ORF的929.968位出現(xiàn)了40 bp的堿基丟失的情況，CIITA-N基因的核苷酸序列在其ORF的225.368位和926-968位分別出現(xiàn)了144 bp和40 bp的堿基丟失；對(duì)CIITA8和CIITA-N進(jìn)行氨

5、基酸推導(dǎo)分析發(fā)現(xiàn)，因?yàn)?26-968位基因片段的丟失，使得這兩個(gè)基因的終止密碼TGA提前，CIITA8和CⅡTA-N編碼的蛋白質(zhì)序列被縮短。所以本實(shí)驗(yàn)所獲得的3條基因序列CⅡTA4、CⅡTA8和CⅡTA-N編碼的蛋白質(zhì)長(zhǎng)度分別為565 aa、312 aa和264 aa，初步推測(cè)這種核苷酸片段的丟失可能與CⅡTA基因的前體mRNA的選擇性剪切有關(guān)。
　　 本研究擴(kuò)增包含CⅡTA4基因3’端的723 bp的核苷酸片段并將其亞克隆到原

6、核表達(dá)載體PET-32a+上，成功構(gòu)建PET-CⅡTA4-C原核表達(dá)載體并將其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL-21中進(jìn)行IPTG的誘導(dǎo)表達(dá)。鑒定重組蛋白CⅡTA4-C的表達(dá)形式后，用Ni-NTA親和層析的方法純化重組蛋白并對(duì)其進(jìn)行復(fù)性，復(fù)性后的重組蛋白免疫小鼠制備多克隆抗體并對(duì)制備的抗體進(jìn)行反應(yīng)性和效價(jià)的檢測(cè)。同時(shí)，我們還構(gòu)建了包含CⅡTA4基因ORF的真核表達(dá)載體PCDNA3.0-GFP-CⅡTA4，并成功在PK-15細(xì)胞上表達(dá)。