鮸魚vibrio ponticus的分離鑒定【畢業(yè)設計】

1、<p><b>　　本科畢業(yè)設計</b></p><p><b>　?。?0_ _屆）</b></p><p>　　鮸魚Vibrio ponticus的分離鑒定</p><p>　　所在學院 </p><p>　　專業(yè)班級

2、 水產養(yǎng)殖學 </p><p>　　學生姓名 學號 </p><p>　　指導教師 職稱 </p><p>　　完成日期 年 月 </p><p><b>　　目 錄</

3、b></p><p><b>　　1 引言1</b></p><p>　　2材料與方法錯誤!未定義書簽。</p><p><b>　　2.1材料1</b></p><p>　　2.2 病原菌的分離2</p><p>　　2.3 菌體形態(tài)觀察及常規(guī)生理生化鑒定2

4、</p><p>　　2.4 病原菌的回歸感染 2</p><p>　　2.5 藥物敏感性實驗2</p><p>　　2.6 細菌基因組序列擴增，測序和分析2</p><p>　　2.6.1細菌基因組DNA提取2</p><p>　　2.6.2 PCR擴增2</p><p>　　2.6

5、.3擴增產物的檢測和克隆2</p><p>　　2.6.4序列分析2</p><p><b>　　3 結果和分析2</b></p><p>　　3.1形態(tài)觀察及常規(guī)生理生化鑒定2</p><p>　　3.2病原菌的回歸感染4</p><p>　　3.3藥物敏感性實驗4</p>

6、;<p>　　3.4細菌基因組序列擴增、測序和分析5</p><p><b>　　4討論5</b></p><p><b>　　5總結7</b></p><p><b>　　致謝7</b></p><p><b>　　參考文獻8</b&g

7、t;</p><p>　　摘要：該論文主要是鑒定一株分離自鮸魚的菌株。主要采用了TCBS平板分離優(yōu)勢菌，形態(tài)學觀察，生理生化特征測定，回歸感染試驗，計算LD50，藥敏試驗測定，16S rRNA序列分析鑒定細菌等鑒定此分離物。通過上述鑒定，該菌株Miiuy croaker –Y090909為革蘭氏陰性，直桿，在25℃下TCBS瓊脂上培養(yǎng)菌落呈黃色的。菌株能在無氣條件下發(fā)酵葡萄糖，氧化酶和過氧化氫酶陽性。它們生長需鈉

8、離子，不能再不添加NaCl的培養(yǎng)基上生長。能8%濃度NaCl下生長，不能再10%濃度NaCl下生長。16S rRNA序列表明與Vibrio ponticus形成一簇，親緣關系最近。本文主要就鮸魚Vibrio ponticus病菌的生理生化、藥敏實驗及16S rRNA序列做了簡單研究，希望能對將來的研究有參考價值。</p><p>　　關鍵詞：Vibrio ponticus；鮸魚；常規(guī)生理生化鑒定；藥物敏感性實驗；

9、16S rRNA測序和分析</p><p>　　Abstract: To identify and characterization of a strain from the spleen of miiuy croaker. In this study, we used conventional biochemical identification, experimental infection, drug se

10、nsitivity tests, 16S rRNA sequencing and analysis, etc. This experiment used TCBS plate to isolate the dominant bacteria. The morphology is Gram-negative and straight rod. The colonies were yellow on TCBS in 25℃. Oxidase

11、 and Catalase were positve. It can grow on the plate with 8% NaCl, but not grow on the plate wi</p><p>　　Keywords: Vibrio ponticus; Miichthys miiuy Basilewsky; conventional biochemical identification; exper

12、imental infection; 16S rRNA sequencing and analysis 1 引言</p><p>　　鮸魚（Miichthys miiuy Basilewsky），一作米魚，形似鱸魚，但肉質略粗糙，體色發(fā)暗，灰褐并帶有紫綠色，腹部灰白。背鰭鰭棘上緣黑色，鰭條部中央有一縱行黑色條紋。胸鰭腋部上方有一晴斑。其余各鰭灰黑色。鮸魚體形為兩側扁平向后延長狀，背、腹部淺弧形。鮸魚分布于北太平洋

13、西部，包括中國的渤海、黃海及東海，朝鮮和日本南部。中國沿海主要產鮸魚的漁場有：廣東潮汕魚場福建平潭島和兄弟島，浙江岱山和舟山群島，江蘇大沙漁場，山東沿海和渤海，尤以東海的舟山群島產量最大，是寧波一帶的海漁特產之一。鮸魚的主要捕撈方法為底拖網(wǎng)或延繩釣，冬春之際產量較高。每年農歷6-8月為舟山群島鮸魚的漁汛期，漁汛期鮸魚以春季生殖洄游和冬季越冬洄游為主，7月為旺汛。每逢大潮汛，漁船競相出海作業(yè)，晨出晚歸，捕獲甚豐。鮸魚肉味鮮美，為海產經濟魚

14、類之一，也是經濟價值較高的魚類。除鮮食外，肉是作魚丸、敲魚面的上等原料，在溫州頗有盛名；全魚還可制作罐頭或加工成鮸魚鲞；魚鰾可制魚膠，有較高的藥用價值，具養(yǎng)血、補腎、潤肺健脾和消炎作用；魚鱗可制鱗膠；內臟、骨可制魚粉、魚油；耳石有清熱去瘀、利尿的作用。鮸魚還是我]國的出口魚類品</p><p>　　隨著鮸魚養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大，由于養(yǎng)殖密度過高，養(yǎng)殖區(qū)域水質惡化嚴重，以及鮸魚經過多代人工繁殖造成性狀退化，導致機體抵

15、抗力下降等原因,病害頻繁發(fā)生且日趨嚴重。近年流行的病害主要是細菌性疾病(弧菌病、腸炎病、爛鰓病等) 、寄生蟲病(纖毛蟲、指環(huán)蟲等) 、水霉病等。其中由弧菌屬細菌引起的疾病，危害最為嚴重，每年都給養(yǎng)殖從業(yè)者造成了極大的經濟損失?；【∈且环N常見的水產動物疾病，在世界各地具有較高的死亡率?；【鷮儆薪?0個種，包括副溶血性弧菌，霍亂弧菌，創(chuàng)傷弧菌和鰻弧菌。一些新的海洋病原弧菌屬，已在近幾年被報告。我們可以確定在不久的未來，隨著流行病學研究的不

16、斷發(fā)展，更多病菌很可能將更多的被發(fā)現(xiàn)和鑒定。</p><p>　　鮸魚弧菌病的病原主要為哈氏弧菌(Vibrio harveyi)。弧菌屬的多種弧菌均能引起養(yǎng)殖魚類弧菌病，癥狀表現(xiàn)為多種多樣：潰瘍、爛尾、腹水、爛眼等，其中潰瘍和爛尾是最常見的癥狀[1-3]。這是一種病程短、范圍廣、死亡率高的疾病，流行時間為6-10月，7-8月為高峰期，一般死亡率為30%-40% 最高可達80%以上。在典型的發(fā)病網(wǎng)箱內，從出現(xiàn)少量病

17、魚到大部分發(fā)病死亡歷時約7d。致病菌的準確快速鑒定是魚病防治的基礎，如何快速準確檢測養(yǎng)殖鮸魚弧菌病，已成為當前鮸魚養(yǎng)殖業(yè)十分重要而突出的問題。</p><p>　　Vibrio ponticus是弧菌屬的一員，2004年發(fā)現(xiàn)的一個新種。目前關于此類鮸魚弧菌病的研究主要是對該菌的分離鑒定以及該菌的致病性還有一些基本的培養(yǎng)特性，其他方面如免疫學、病理學等方面很少涉及。然而作為新發(fā)現(xiàn)的海洋致病菌，對其的研究有著極其重要

18、的經濟價值和生態(tài)價值。本文主要通過傳統(tǒng)方法及16S rRNA序列分析的方法鑒定分離自鮸魚的細菌，分別從生理生化、藥敏實驗和16S rRNA序列分析等方面鑒定該菌株為V.ponticus。</p><p><b>　　2 實驗方法</b></p><p>　　2.1主要試劑和儀器</p><p>　　離心機和超低溫冰柜均購自德國Thermo公司，

19、恒溫振蕩器購自江蘇省華利達試驗設備公司，電熱恒溫培養(yǎng)箱購自日本EYELA公司，高壓蒸汽滅菌鍋購自日本ALP公司， PCR儀購自美國BIO -RAD公司；普通營養(yǎng)瓊脂和TCBS培養(yǎng)基、藥敏紙片（鏈霉素、新生霉素、氯霉素、四環(huán)素、青霉素G、先鋒霉素V、頭咆哌酮、羧芐青霉素和氨芐青霉素共10種）（杭州天河微生物試劑有限公司）和細菌微量生化反應管（乳糖、木糖、肌醇、V-P試驗 、MR試驗 、靛基質試驗、蔗糖、鳥氨酸脫羧酶、賴氨酸脫羧酶等共38種

20、）均購置杭州天河微生物試劑有限公司；T4 DNA連接酶、pMD19-T載體和Ex Taq聚合酶等均購自Takara公司。</p><p><b>　　2.2病原菌的分離</b></p><p>　　樣品：選取癥狀典型的瀕死病魚。</p><p>　　無菌條件下取病魚體表潰瘍、肝、脾、腎等部位作為材料，用普通營養(yǎng)瓊脂和TCBS平板做細菌分離，置2

21、8°C培養(yǎng)24 h。結果從被檢材料中分離到純度一致的菌株，命名為Miiuy croaker –Y090909，純培養(yǎng)后-70°C保存?zhèn)溆谩?lt;/p><p>　　2.3菌體形態(tài)觀察及常規(guī)生理生化鑒定</p><p>　　用普通光鏡觀察分離細菌的形態(tài)。參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》 和《伯杰氏細菌學鑒定手冊》方法對其進行生理生化特征測定。取分離的純培養(yǎng)菌，接種于普通液體培養(yǎng)基

22、中，并放置于28℃的搖床中培養(yǎng)24h，使用細菌微量生化反應管測定鳥氨酸脫羧酶、賴氨酸脫羧酶、精氨酸雙水解酶、β-半乳糖苷（ONPG）、氧化酶、接觸酶、乳糖、木糖、蔗糖、半乳糖、鼠李糖、甘露糖、麥芽糖、阿拉伯糖、蜜二糖、葡萄糖、甘露醇、肌醇、山梨醇、丙二鹽酸、明膠、硫化氫、尿素、七葉苷、水楊素、葡萄糖（產氣）、葡萄糖磷酸鹽(V-P試驗)、蛋白胨水（靛基質）、葡萄糖磷酸鹽（M-R試驗）、葡萄糖酸鹽、西蒙氏枸櫞酸鹽的生理生化特性測定，以及分離

23、病原菌在無鹽胨水、3%氯化鈉胨水、6%氯化鈉胨水、8%氯化鈉胨水、10%氯化鈉胨水的生長狀況。</p><p>　　2.4病原菌的回歸感染</p><p>　　選擇無外傷、游動活潑，重量在200g左右的健康鮸魚作為供試魚，將鮸魚置于塑料桶中暫養(yǎng)1周，穩(wěn)定后隨機分組進行試驗，每4尾魚為1組。試驗用水為天然海水，水溫為20(±1)℃ 。分別取0．1 mL菌懸液，對試驗組魚進行腹腔注射

24、感染，同時給對照組魚腹腔注射無菌生理鹽水0．1 mL。試驗期間連續(xù)充氣，每天換水1次，投餌1次。人工感染后連續(xù)觀察7d，連續(xù)觀察魚的體色、活動力、攝食、發(fā)病癥狀和死亡情況。用酒精棉球對病魚的體表消毒，對瀕死病魚進行病理變化檢驗，然后在無菌條件下取下肌肉、腎、肝和脾等部位的組織小塊劃線接種于TCBS培養(yǎng)基平板，在28℃下恒溫倒置培養(yǎng)24 h。挑取平板中形態(tài)特征一致的優(yōu)勢菌，接種于TCBS培養(yǎng)及平板，在28℃下恒溫倒置培養(yǎng)24 h，觀察菌落

25、形態(tài)。</p><p>　　2.5藥物敏感性實驗</p><p>　　用藥敏紙片法在普通營養(yǎng)瓊脂平板上測定鮸魚病原菌對藥物的敏感性。在28℃恒溫培養(yǎng)24 h后，測量抑菌圈直徑大小。再根據(jù)紙片法藥敏試驗抑菌圈直徑判斷標準得出對各種抗菌藥物的敏感性。</p><p>　　2.6細菌基因組序列擴增、測序和分析</p><p>　　2.6.1 細菌基

26、因組DNA提取：</p><p>　　采用Wilson描述的方法提取鮸魚病原菌的基因組DNA作為模板。</p><p>　　2.6.2 PCR擴增：</p><p>　　16S rRNA基因PCR擴增所需要的兩個引物為16S（+）：5'-AGA GTT TGA TCATGG CTC AG-3' 、16S（-）：5'-GGT TAC CTT G

27、TT ACG ACT T-3'。 在20μL的PCR反應體系中含有：引物各0.2μL，模板DNA1μL，2.5U/μL的Taq DNA聚合酶0.2μL ，4×dNTP混合物0.4μL，1×PCR緩沖液2μL，無菌蒸餾水14.4μL，1.5mmol/L MgCl2 1.6μL。PCR反應條件為：94℃預變性3min，接著94℃變性30s、55℃復性1min和72℃延伸2min如此30個循環(huán)后，72℃溫育6min

28、。</p><p>　　2.6.3 擴增產物的檢測和克?。?lt;/p><p>　　瓊脂糖凝膠檢測PCR產物，預期大小的擴增條帶回收后克隆至pMD19-T載體，序列測定由上海英駿生物技術有限公司完成。</p><p>　　2.6.4 序列分析：</p><p>　　采用ClustalW程序進行多重序列比對后，用MEGA 4.0軟件構建系統(tǒng)進化樹。

29、</p><p><b>　　3結果及分析</b></p><p>　　3.1 形態(tài)觀察及常規(guī)生理生化鑒定</p><p>　　菌株為革蘭氏陰性菌（見圖1），直桿，長度約3.0μm，寬度約1.5μm，有1-2根極生鞭毛。菌落光滑，圓形，無色素，不發(fā)光，不泳動。它們培養(yǎng)基上培養(yǎng)在25℃下，經48 小時，長出的菌落為2-3mm。在25℃下TCBS瓊

30、脂上培養(yǎng)48小時后是黃色的。菌株生長需要Na+。能在8%Nacl條件下能生長，不能在10%Nacl中生長。在4℃、40℃下不生長。</p><p>　　圖1 優(yōu)勢菌革蘭氏染色(100 x)</p><p>　　Fig.1 Gram stain of The dominant bacteria (100 x)</p><p>　　生理生化特征：對半乳糖，甘露糖，甘露醇

31、，麥芽糖，葡萄糖磷酸鹽（MR），賴氨酸脫羧酶，賴氨酸脫羧酶，精氨酸雙水解酶，氧化酶，接觸酶等顯陽性；對乳糖，木糖，肌醇，蔗糖，山梨醇，鼠李糖，丙二鹽酸，阿拉伯糖，明膠，蜜二糖，硫化氫，葡萄糖磷酸鹽(VP)，西蒙氏枸櫞酸鹽，蛋白胨水（靛基質），β-半乳糖苷（ONPG），尿素，七葉苷，水楊素等顯陰性（見表1）。</p><p>　　表1 Vibro ponticus常規(guī)生理生化鑒定</p><p&

32、gt;　　Tab.1 Physiological and biochemical characteristics of isolates</p><p><b>　　3.2回歸感染實驗</b></p><p>　　注射無菌的對照組安然無恙。對魚進行腹腔注射，在感染后的3天，不同程度呈現(xiàn)出潰瘍及皮下出血癥狀。該菌株可重新從死魚腎臟中分離得到。</p>&l

33、t;p>　　3.3藥物敏感性實驗</p><p>　　用紙片法測定了具有代表性的12種抗菌藥物對菌株Miiuy croaker –Y090909的抑制作用，結果表明該菌對鏈霉素，四環(huán)素，氨芐青霉素，丁胺卡那，青霉素G等藥物表現(xiàn)為中敏；而對頭咆哌酮，羧芐青霉素，新生霉素，氯霉素，先鋒霉素V，O/129診斷試紙等藥物表現(xiàn)為高敏(見表2)。</p><p>　　表2 ：Vibro pont

34、icus藥物敏感性實驗</p><p>　　Tab.2 pharmic sensitivity of isolates </p><p>　　注：“-”表示無抑菌圈，“S”表示敏感，“I”表示中介，“R”表示耐藥。</p><p>　　Note：“-”：no zone of inhibition around disk；

35、“S” =sensitive；“I”= interim；“R”=resistant．</p><p>　　3.4細菌基因組序列擴增、測序和分析</p><p>　　菌株Miiuy croaker –Y090909的16S rRNA基因擴增產物純化后，分別克隆并測定序列。細菌16S rRNA基因1513個核苷酸序列比較表明，Miiuy croaker –Y090909與Vibro ponti

36、cus核苷酸序列同源性最高，為99.4%~99.5%[4]。16S rRNA基因系統(tǒng)進化樹分析表明，Miiuy croaker –Y090909與Vibro ponticus系統(tǒng)進化相關性最高，與同科的弧菌屬成員進化相關性次之，但與同屬其他兩個成員進化相關性較遠（圖2）。序列分析結果揭示，菌株Miiuy croaker –Y090909與Vibro ponticus是一個分離物[5]。</p><p>　　圖2

37、部分弧菌科成員16S rRNA基因核苷酸序列的系統(tǒng)進化樹分析</p><p>　　Fig:2 Members of Vibrionaceae nucleotide sequences of 16S rRNA gene phylogenetic analysis</p><p><b>　　4 討論</b></p><p>　　V.ponticu

38、s是弧菌屬的一員，2004年發(fā)現(xiàn)的一個新種。目前關于此類弧菌病的研究主要是對該菌的分離鑒定以及該菌的致病性還有一些基本的培養(yǎng)特性，其他方面如免疫學、病理學等方面很少涉及。然而作為新發(fā)現(xiàn)的海洋致病菌，對其的研究有著極其重要的經濟價值和生態(tài)價值。本文主要通過傳統(tǒng)方法鑒定該菌。分別從生理生化、藥敏實驗和16S rRNA序列分析等方面來鑒定菌株，得出分離出的細菌為V.ponticus。</p><p>　　本次對V. p

39、onticus的菌種判定，是通過比較系統(tǒng)的表觀生物學分類指征檢驗與16S rRNA基因序列測定與系統(tǒng)發(fā)育學分析相結合在一起進行的。就個別的生理生化特性指標來講，該分離菌與記載的生化性質存在著一些差異。這些表明在對細菌進行種的鑒定時不能僅僅依賴于生化指標的完全一致性，從不同地方分離而來的同種菌株間可能存在著個別生理生化特性的差異。藥敏測定結果顯示，在所測得10種藥物中，結果表明該菌對鏈霉素，四環(huán)素，氨芐青霉素，丁胺卡那，青霉素G等藥物表現(xiàn)

40、為中敏；而對頭咆哌酮，羧芐青霉素，新生霉素，氯霉素，先鋒霉素V，O/129診斷試紙等藥物表現(xiàn)為高敏?？赡芤驗樵摼隇樾滦妥儺惖木辏瑢λ幬锏拿舾行赃€較高。但是我們在平時的用藥過程中還是要注意適度原則，避免使該菌株出現(xiàn)對大量的藥物耐藥的現(xiàn)象。總之，本實驗對分離菌株進行了較為系統(tǒng)的生理生化特性的檢驗，相對地豐富了V. ponticus的一些生物學性狀內容，將可能有益于對該菌的分離與鑒定。</p><p>　　V.po

41、nticus研究報道較少。最早在2004年，Macia'n等首次分離自在西班牙海水中貽貝和病變鯛（金頭鯛）。其研究發(fā)現(xiàn)，四個V.ponticus株（AJ630103，AJ630102，AJ630202，AJ630203）和河流弧菌和V. furnissii 在16 rDNA序列上有高度同源（大于97％），但吲哚和賴氨酸脫羧酶基因處有所不同，這兩個酶與表型功能密切相關。此外，河流弧菌和V. furnissii在40℃均能生長，并且

42、能水解明膠，但V.ponticus卻不能。Xie 等研究中還利用了UPPCR - DGGE技術迅速檢測細菌病原體，在DGGE模式研究的基礎上，鑒定結果所有分離出的V.ponticus菌株是同一種類。這證明V.ponticus是廣東流行的日本鱸魚的病原。</p><p>　　傳統(tǒng)方法檢測包括直接培養(yǎng)、生理生化方法、組織切片觀察法和超薄切片電鏡觀察法，是目前養(yǎng)殖魚類弧菌病診斷的主要方法。另外，關于魚類弧菌病的檢測方法

43、，還有一種先進的比較常用的技術——免疫學技術。免疫學技術是利用特異性抗原抗體反應,觀察和研究組織細胞特定抗原(或抗體)的定位和定量技術。具有高特異性、高靈敏性等特點，該技術將抗原、抗體的免疫反應相結合，縮短了病原菌的檢測時間,提高了診斷的準確性，是目前養(yǎng)殖鮸魚弧菌病早期檢測技術中研究較為廣泛深入的檢測技術。</p><p>　　熒光抗體技術是根據(jù)抗原抗體反應具有高度的特異性，以熒光素作為標記物，與已知的抗體結合(

44、不影響其免疫特性)作為標準試劑，用于鑒定未知的抗原，可在熒光顯微鏡下檢查呈現(xiàn)熒光的特異性抗原抗體復合物及其存在部位。此項技術是應用免疫反應的特異性與靈敏性，并與顯微鏡的精確性相結合，成為現(xiàn)代免疫學研究中的標記免疫檢測方法之一。王軍[6]、鄢慶枇[7]等分別建立了檢測鮸魚溶藻弧菌,副溶血弧菌的間接熒光抗體快速檢測技術。免疫熒光技術不僅能快速檢測患病動物的病原，檢測的時間一般不超過3h，為疾病的及時對癥治療贏得了寶貴的時間，而且該方法還能夠

45、檢測到帶菌狀態(tài)或未發(fā)病的被感染個體。姚斐[8]等報道了利用間接免疫熒光技術還可檢出處于活的非可培養(yǎng)狀態(tài)的細菌，由于活的非可培養(yǎng)狀態(tài)的細菌仍具有毒性，并可在一定條件下復蘇造成疾病的暴發(fā)流行，因此加強活的非可培養(yǎng)狀態(tài)病原菌的檢測在鮸魚弧菌病的預測預報上是很有意義的。但免疫熒光技術的缺點是非特異性染色問題難以完全解決；操作程序較繁瑣;需要特殊的昂貴儀器(熒光顯微鏡)；染色標本不能長期保存等。</p><p>　　免疫酶

46、技術也是免疫學診斷的一條新途徑,與免疫熒光技術相比，它只需普通光學顯微鏡即可進行觀察。它利用了抗原- 抗體反應的高度特異性和酶促反應的高度敏感性，通過肉眼或顯微鏡觀察及分光光度計測定,達到在細胞或亞細胞水平上示蹤抗原或抗體的位置,以及對其進行定量的目的。該方法具有高效、經濟、方便等特點。按是否將抗原或抗體結合到固相載體上,免疫酶技術可分為固相、均相和雙抗體酶免疫測定技術。酶聯(lián)免疫吸附試驗( EL ISA)是目前應用最廣泛的固相免疫酶測定

47、技術。楊鳶劼[9]等建立了檢測鰻弧菌的間接EL ISA技術，其檢測的敏感性閾值為1 ×105 個/mL。鄢慶枇[10]、王軍[11]分別改良了間接EL ISA 法檢測鮸魚溶藻弧菌和副溶血弧菌，其最低檢測極限分別為為9. 7 ×104 cfu /mL和5. 0 ×104 cfu /mL。酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)不僅可以用于患病鮸魚的診斷，也可以用于無病癥帶菌鮸魚的檢測,結果可多次重復，穩(wěn)定，底物顯色清晰

48、，不需特殊儀器用肉眼即可觀察，快速，并同時可測大量的樣品。為了更好地將這種快速、靈敏、準確的檢測方法應用于養(yǎng)殖生產實踐，必須要在縮短檢測時間、提</p><p>　　免疫學方法雖比傳統(tǒng)方法在許多方面有了較大進步，也存在不少問題。抗體在體內的形成往往需要一段時間，而且抗體一旦產生,即使病愈后還可能長時間存在，陽性結果還不能做出確診。酶聯(lián)免疫吸附實驗具備免疫學方法的長處，靈敏度高，但操作麻煩，除了對抗血清要求嚴格外，

49、還可能存在一定程度的交叉反應，并且其結果受樣品濃度影響，易出現(xiàn)假陽性或微陽性。隨著現(xiàn)代分子生物學技術的高速發(fā)展，聚合酶鏈式反應和分子雜交等手段為鮸魚弧菌病檢測提供了新N的研究思路。</p><p>　　分子生物學檢測技術是最近新流行的一種檢測方法，它包括PCR及其衍生技術，PCR與分子雜交聯(lián)用技術和16S rRNA和熱激蛋白基因檢測技術</p><p>　　PCR及其衍生技術即酶鏈反應技術

50、( PCR)，是指在引物的作用下,體外酶促反應，迅速擴增DNA片段的一種方法。該技術具有特異性好、對感染早期診斷非常有效、檢測速度快且靈敏等優(yōu)點。國內外關于弧菌的分子檢測主要集中在霍亂弧菌，副溶血弧菌的研究上,偏重于醫(yī)學、食品安全和水域環(huán)境方向[12,13] ，但對養(yǎng)殖鮸魚弧菌病早期檢測具有很強的借鑒意義，是未來鮸魚弧菌病檢測發(fā)展的主流。Kim，Lee等針對副溶血弧菌部分toxR基因，直接溶血素基因, pR72H片段分別建立了多種特異性

51、PCR 檢測方法[14~17]。Conejero和L Pang針對哈維氏弧菌的部分toxR基因和溶血素基因分別建立了特異性PCR 檢測技[18~20]。常規(guī)的PCR檢測法為單對引物擴增一種病原體DNA，一次只能檢測一種病原體或一個基因型別，基因型別和混合感染的檢測顯得操作煩瑣，費時且成本高，而且容易產生漏診。而養(yǎng)殖鮸魚可能致病性弧菌種類多，病癥表現(xiàn)多樣，難以用一種方法進行確診。多重PCR技術是將多對引物混合后于一個反應管中同時進行多種病

52、原體擴增,能有效地解決上述問題,一種方法能檢出多種致病性弧菌,使得診斷及分型變得簡捷。D</p><p>　　PCR與分子雜交聯(lián)用技術在國內外構建弧菌的基因文庫或部分基因文庫的研究工作并不算多，對于一些弧菌的特異性核酸探針的制備尚有較大困難。另外，分子雜交檢測靈敏度要比PCR方法低，分子雜交聯(lián)用法來檢測病原可以提高靈敏度。蔣魯巖[22]等在PCR技術基礎上，合成探針，應用D IG標記試劑盒對特異擴增產物進行標記，

53、標記探針可與副溶血弧菌DNA的TDH基因特異性地雜交，從而建立了副溶血弧菌的斑點雜交檢測方法?？梢酝瑫r處理數(shù)百甚至上千份樣品,適于大批量標本檢測，同時應用非放射性探針，快速簡便且對操作者健康無害。副溶血弧菌也是鮸魚弧菌病的可能致病菌之一，將之進行改良制成試劑盒也可應用于鮸魚弧菌病的檢測中。</p><p>　　16S rRNA為所有生物體生存所必需的基因序列并且也是較保守的序列之一。16S rRNA的序列檢測已被

54、成功地建立為一種鑒定微生物種、屬、家族種類的標準方法。</p><p>　　目前，16S rRNA檢測技術在人醫(yī)及獸醫(yī)開始得到廣泛應用，在水產病害方面也開始運用。但由于16S rRNA的進化速度非常慢，即太保守，無法區(qū)分某些種系非常接近的菌種及同一菌種的不同菌株。而熱激蛋白(Heat shockp rotein, HSP)是另一類常用于生物進化和分類研究的大分子物質。廣泛存在于細菌及真核生物細胞中。其主要功能是作

55、為分子伴侶參與蛋白質肽鏈折疊和組裝。進化速度比16S rRNA快,攜帶更多的多態(tài)信息。我們對養(yǎng)殖鮸魚多種致病性弧菌分別進行16S rRNA和HSP分子鑒定，發(fā)現(xiàn)HSP60基因更適合用于研究海洋弧菌系統(tǒng)分類鑒定，以HSP60基因構建的系統(tǒng)樹在置信度上普遍明顯高于16S rRNA 基因。這與李寧求[23]、張偉妮[24]、Kwok[25]等的研究結論一致。</p><p><b>　　5 總 結</b

56、></p><p>　　本次對V.ponticus的菌種判定，是通過比較系統(tǒng)的表觀生物學分類指征檢驗與16S rRNA基因序列測定與系統(tǒng)發(fā)育學分析相結合在一起進行的。就個別的生理生化特性指標來講，該分離菌與記載的生化性質存在著一些差異。這些表明在對細菌進行種的鑒定時不能僅僅依賴于生化指標的完全一致性，從不同地方分離而來的同種菌株間可能存在著個別生理生化特性的差異。藥敏測定結果顯示，在所測得10種藥物中，結果

57、表明該菌對鏈霉素，四環(huán)素，氨芐青霉素，丁胺卡那，青霉素G等藥物表現(xiàn)為中敏；而對頭咆哌酮，羧芐青霉素，新生霉素，氯霉素，先鋒霉素V，O/129診斷試紙等藥物表現(xiàn)為高敏?？赡芤驗樵摼隇樾滦妥儺惖木辏瑢λ幬锏拿舾行赃€較高。但是我們在平時的用藥過程中還是要注意適度原則，避免使該菌株出現(xiàn)對大量的藥物耐藥的現(xiàn)象?？傊?，本實驗對分離菌株進行了較為系統(tǒng)的生理生化特性的檢驗，相對地豐富了V.ponticus的一些生物學性狀內容，將可能有益于對該菌的分

58、離與鑒定。</p><p><b>　　參考文獻</b></p><p>　　[1] 林克冰,周宸,劉家富,等. 海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖鮸魚弧菌病的病原菌[J].臺灣海峽,1999, 12(3):342～345.</p><p>　　[2] 王軍,蘇永全,張朝霞,等. 閩南地區(qū)養(yǎng)殖鮸魚細菌性疾病的病原生物學研究[J].廈門大學學報(自然科學版),2001

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