鈣激活氯離子通道在氣道杯狀細(xì)胞合成黏蛋白中的促進(jìn)作用

1、<p>　　鈣激活氯離子通道在氣道杯狀細(xì)胞合成黏蛋白中的促進(jìn)作用</p><p>　　作者：宋立強(qiáng)，戚好文，李妍，王吉村，林愛華 </p><p>　　【關(guān)鍵詞】 杯狀細(xì)胞 </p><p>　　【Abstract】 AIM: To investigate the effects of human calciumactivated chloride c

2、hannel 1 (hCLCA1) on synthesis of mucin in airway goblet cells. METHODS: Recombined eukaryotic expression plasmid pIRES2EFGP/hCLCA1, which contained fluorescence tag and G418 screening flag was constructed. The plasmid

3、was stably transfected into NCIH292 cell line, which was regarded as goblet cell model in vitro. Transfected NCIH292/hCLCA1 cells were identified by fluorescence microscopy and hCLCA1 mRNA was detected</p><p&g

4、t;　　【Keywords】 asthma; airway; epithelial cells; goblet cells; chloride channel </p><p>　　【摘要】 目的： 探討人激活Cl通道I型（hCLCA1）在氣道杯狀細(xì)胞合成黏蛋白中的調(diào)控作用. 方法： 以人氣道黏液上皮細(xì)胞系NCIH292作為杯狀細(xì)胞特性研究的體外模型，構(gòu)建攜帶熒光蛋白標(biāo)簽的真核表達(dá)質(zhì)粒pIRES2EFGP

5、/hCLCA1，轉(zhuǎn)染NCIH292細(xì)胞，用G418篩選穩(wěn)定表達(dá)hCLCA1的細(xì)胞NCIH292/hCLCA1. 對被轉(zhuǎn)染細(xì)胞采用熒光顯微鏡和RTPCR法檢測hCLCA1 mRNA. 根據(jù)NFA（hCLCA1阻斷劑）干預(yù)與否，將細(xì)胞分為4組： ① NCIH292；② NCIH292/hCLCA1；③ NCIH292+NFA；④ NCIH292/hCLCA1+NFA. MTT法檢測各組細(xì)胞的增殖活性；PAS特染法檢測各組細(xì)胞黏液糖蛋白的表達(dá)

6、狀況, RTPCR法檢測黏蛋白MUC5AC mRNA水平. 結(jié)果： 經(jīng)過500g/L的G418篩選，證實(shí)獲得NCIH292/hCLCA1細(xì)胞. 對各組細(xì)胞檢測結(jié)果表明，NCIH292/hCLCA1細(xì)胞的增殖活性、黏液糖蛋白表達(dá)量及MUC5AC mRNA水平均顯著高于親本細(xì)胞，并且NFA能有效抑制NCIH292/hCLCA1的這</p><p>　　【關(guān)鍵詞】 哮喘；氣道；上皮細(xì)胞；杯狀細(xì)胞；氯化物通道 <

7、;/p><p><b>　　0引言 </b></p><p>　　氣道上皮杯狀細(xì)胞增生及伴隨的黏蛋白高分泌是哮喘的主要病理特點(diǎn)之一，并已成為病情加重的指征［1］. 杯狀細(xì)胞產(chǎn)生的黏蛋白MUC5AC被認(rèn)為是該細(xì)胞增生的標(biāo)志［2］. NCIH292是一種人氣道黏液上皮細(xì)胞系，能產(chǎn)生多種黏蛋白，常被作為杯狀細(xì)胞功能特點(diǎn)研究的體外模型［3］. Hoshino等［4］和Toda等［

8、5］相繼證實(shí)，哮喘患者氣道杯狀細(xì)胞的人鈣激活Cl通道I型（human calciumactivated chloride channel, hCLCA1）高表達(dá). hCLCA1屬于一種新近發(fā)現(xiàn)的跨膜陰離子通道家族，一般認(rèn)為該家族與胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)水和電解質(zhì)的功能相關(guān). 我們擬利用體外培養(yǎng)NCIH292細(xì)胞，探討hCLCA1與黏蛋白合成的關(guān)系. </p><p><b>　　1材料和方法 </b>&l

9、t;/p><p><b>　　1.1材料 </b></p><p>　　人氣道黏液上皮細(xì)胞系NCIH292(西京醫(yī)院呼吸內(nèi)科實(shí)驗(yàn)室保存)；pcDNA3.1(+)/hCLCA1質(zhì)粒(美國Levitt RC教授惠贈)；CLCA阻斷劑NFA（niflumic acid）(Sigma公司)；大腸桿菌JM109及真核表達(dá)載體pIRES2EGFP（具有雙順反子）（第四軍醫(yī)大學(xué)生物化學(xué)

10、與分子生物學(xué)教研室）；γTaq DNA多聚酶、T4 DNA連接酶及限制性內(nèi)切酶NheⅠ, XholⅠ （TaKaRa公司）；RevertAidTM逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Fermentas公司）. </p><p><b>　　1.2方法 </b></p><p>　　1.2.1pIRES2EGFP/hCLCA1表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建采用NheⅠ和XholⅠ從質(zhì)粒pcDNA3.1(+)

11、/hCLCA1中切出hCLCA1基因片段，將其亞克隆入相同酶切的載體pIRES2EGFP，重組質(zhì)粒命名為pIRES2EGFP/hCLCA1. 轉(zhuǎn)染大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，鋪板（含卡那霉素），挑克隆，酶切電泳鑒定. 測序鑒定由上海鼎安科技公司完成. </p><p>　　1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染及篩選① 新霉素（G418）濃度的確定以細(xì)胞密度4×105 /孔將NCIH292細(xì)胞接種于24孔板中，采用含10

12、0 mL/L滅活小牛血清的DMEM進(jìn)行培養(yǎng)，并分別加入梯度濃度G418（200, 300, 400, 500, 600, 700, 800 g/L）. 培養(yǎng)10~14 d，選擇能全部殺死細(xì)胞所用G418的最低濃度. ② 轉(zhuǎn)染與篩選參照Lipofect AMINE 2000TM試劑說明書，在Lipofectin介導(dǎo)下將pIRES2EFGP/hCLCA1轉(zhuǎn)染NCIH292細(xì)胞. 72 h后，改用含G418培養(yǎng)液篩選3~4 wk. 獲得的細(xì)胞

13、命名為NCIH292/hCLCA1. </p><p>　　1.2.3轉(zhuǎn)染細(xì)胞鑒定① 熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光蛋白表達(dá)情況. ②分別收集轉(zhuǎn)染細(xì)胞NCIH292/hCLCA1和親本細(xì)胞NCIH292，經(jīng)TRI REAGENT抽提細(xì)胞總RNA，按照RevertAidTM逆轉(zhuǎn)錄試劑盒產(chǎn)品說明操作步驟，合成cDNA第1鏈，紫外吸收法定量后，用PCR法擴(kuò)增目的片段. 參照文獻(xiàn)［3］合成hCLCA1及內(nèi)參照GAPDH的上下游

14、引物. hCLCA1 5′端引物： TGA TGC TAC TAA GGA TGA C，3′端引物： TTC CTC AGA GTT GGC TTC CT. GAPDH 5′端引物： ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC，3′端引物： TCC ACC ACC ACC CTG TTG CTG TA. hCLCA1循環(huán)參數(shù)： 94℃變性30 s， 63℃退火1 min，72℃延伸1 min； GAPDH循環(huán)參數(shù)： 94℃變性

15、20 s， 59℃退火20 s， 72℃延伸20 s；均循環(huán)35次. 各PCR擴(kuò)增產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳鑒定. </p><p>　　1.2.4細(xì)胞分組根據(jù)NFA干預(yù)與否分成4組： ① NCIH292；② NCIH292+NFA,待細(xì)胞長至對數(shù)生長期，加入終濃度為100 mg/L的NFA干預(yù)24 h; ③ NCIH292/hCLCA1；④ NCIH292/hCLCA1+NFA，干預(yù)方案同②. 各組實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次.

16、</p><p>　　1.2.5MTT法檢測細(xì)胞的增殖活性將各組細(xì)胞以5×104/孔種植于96孔培養(yǎng)板，待NFA干預(yù)24 h后，每孔加入MTT溶液200 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h. 去上清，每孔加入DMSO 200 μL. 輕度振蕩混勻后，用酶聯(lián)免疫吸附測定儀測定A490 nm. </p><p>　　1.2.6PAS特染法檢測細(xì)胞黏液糖蛋白的表達(dá)取各組細(xì)胞爬片，高碘酸氧化液中浸泡1

17、0~20 min. 蒸餾水洗2次. Schiff液染色10 min. 流水清洗5 min. 用Harris明礬蘇木精襯染核2~3 min. 5 mL/L鹽酸乙醇分化30 s，自來水沖洗5 min返藍(lán). 系列乙醇脫水，二甲苯透明，封片. </p><p>　　1.2.7RTPCR法檢測黏蛋白MUC5AC mRNA同1.2.3中RTPCR步驟，合成各組細(xì)胞cDNA第1鏈后，進(jìn)行目的片段的擴(kuò)增. 參照文獻(xiàn)［6］合成MU

18、C5AC的上下游引物，MUC5AC 5′端引物： TCC GGC CTC ATC TTC TCC，3′端引物： ACT TGG GCA CTG GTG CTG. 94℃變性30 s，60℃退火50 s， 72℃延伸50 s，循環(huán)35次. GAPDH為內(nèi)參照. 利用ImageTool 3.0圖像分析軟件，測量各組MUC5AC條帶與GAPDH條帶的灰度值. </p><p>　　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理： 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±

19、s表示，通過SPSS 10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析. 多組間比較采用析因設(shè)計(jì)資料的方差分析. </p><p><b>　　2結(jié)果 </b></p><p>　　2.1重組質(zhì)粒pIRES2EGFP/hCLCA1的鑒定將質(zhì)粒pIRES2EGFP/hCLCA1用NheⅠ和XholⅠ雙酶切后電泳，得到5300 bp和2900 bp 2個(gè)片段，分別與載體及目的基因的預(yù)期大小一致.

20、 初步說明重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建正確（Fig 1）. 測序結(jié)果顯示，目的基因片段的序列與GenBank中No.AF039400的登錄序列完全相同. </p><p>　　2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果梯度濃度G418的干預(yù)結(jié)果表明，500 g/L為最適篩選濃度，連續(xù)篩選3 wk. 倒置顯微鏡下觀察，所有存活細(xì)胞呈現(xiàn)單層貼壁生長的梭性或多邊形，與親本NCIH292細(xì)胞形態(tài)相似. 熒光顯微鏡下觀察可見，NCIH292/hCLCA1細(xì)

21、胞的整個(gè)胞體顯現(xiàn)出淡綠色熒光，尤以胞核明顯. RTPCR法檢測hCLCA1 mRNA水平，電泳結(jié)果可見NCIH292/hCLCA1細(xì)胞組在預(yù)期523 bp處出現(xiàn)清晰條帶，而親本細(xì)胞組為陰性. 其中GAPDH cDNA大小為411 bp （Fig 2）. 標(biāo)簽蛋白翻譯水平和目的蛋白轉(zhuǎn)錄水平的檢測均表明，重組質(zhì)粒pIRES2EGFP/hCLCA1轉(zhuǎn)染及表達(dá)過程成功. </p><p>　　2.3細(xì)胞增殖活性與NCI

22、H292細(xì)胞組相比，NCIH292/hCLCA1細(xì)胞組的A490 nm值顯著升高（P&lt;0.01），NCIH292細(xì)胞+NFA組A490 nm值有降低的趨勢,但尚無顯著差別. NCIH292/hCLCA1細(xì)胞+NFA組的A490 nm值，明顯低于NCIH292/hCLCA1細(xì)胞組（P&lt;0.01），但仍然高于NCIH292細(xì)胞組（P&lt;0.01, Fig 3）. </p><p&g

23、t;　　2.4細(xì)胞黏液糖蛋白的表達(dá)NCIH292/hCLCA1細(xì)胞的胞質(zhì)普遍出現(xiàn)深紫紅色顆粒；而其他3組的細(xì)胞胞質(zhì)均呈很淡的紫紅色，且著色程度相近（Fig 4）. </p><p>　　2.5黏蛋白MUC5AC mRNA水平由Fig 5電泳結(jié)果可見，各組均在預(yù)期679 bp處出現(xiàn)特異性條帶. NCIH292/hCLCA1細(xì)胞組的灰度值（235±3）明顯高于NCIH292細(xì)胞組（173±3）和N

24、CIH292/hCLCA1細(xì)胞+NFA組（180±5）（均P&lt;0.01），而后兩組的灰度值之間仍有差異. NCIH292細(xì)胞組與NCIH292細(xì)胞+NFA組的灰度值（169±4）無顯著差別. 各組內(nèi)參照之間無差異. </p><p><b>　　3討論 </b></p><p>　　黏液糖蛋白主要由杯狀細(xì)胞產(chǎn)生，是氣道粘液層的主要成份

25、，并能使黏液具備彈性和粘附性的生理特性. 然而，杯狀細(xì)胞異常增生或化生及由此產(chǎn)生的氣道黏液高分泌，是哮喘的重要病理特征. 臨床研究證實(shí)，黏液高分泌病史是肺功能第1秒用力呼氣量（FEV1）下降加速的獨(dú)立危險(xiǎn)因素. 在哮喘病情加重過程中，這種過度分泌而導(dǎo)致的氣道阻塞尤為突出，常成為重癥哮喘的主要死因之一. 由于杯狀細(xì)胞產(chǎn)生黏蛋白的機(jī)制尚未完全弄清，目前臨床沒有針對性藥物. 近年來，IL9， IL4， IL13等Th2細(xì)胞因子等外界因素以及杯

26、狀細(xì)胞自身表皮生長因子受體（EGFR）、凋亡抑制蛋白Bcl2等對粘蛋白產(chǎn)生的促進(jìn)作用，先后得到證實(shí)［7］. 尤其引人注目的是杯狀細(xì)胞CLCA與黏蛋白分泌的關(guān)系. 2001年Nakanishi等［3］首先利用正義和反義RNA技術(shù)證明，小鼠氣道杯狀細(xì)胞鈣激活Cl通道Ⅲ型（mCLCA3）高表達(dá)，是致敏哮喘小鼠粘液高分泌的關(guān)鍵環(huán)節(jié). 而正常小鼠mCLCA3表達(dá)量極低. 次年Hoshino等［4］報(bào)道m(xù)CLCA3的異種同源蛋白hCLCA1在哮喘患

27、者杯狀細(xì)胞高表達(dá)，是正常人群的近3倍. Toda等［5］的結(jié)果還表明</p><p>　　PAS特染及RTPCR法檢測表明，NCIH292/hCLCA1細(xì)胞中黏蛋白MUC5AC的含量顯著高于親本細(xì)胞. 這與在體研究結(jié)果相一致［3］. 而CLCA通道阻斷劑NFA有效減低了NCIH292/hCLCA1細(xì)胞的高增殖活性、黏蛋白高表達(dá). 正反兩方面均證實(shí)hCLCA1對粘蛋白合成具有促進(jìn)作用. 這可能與CLCA對胞內(nèi)高Ca

28、2＋的維持有著正反饋效應(yīng)有關(guān)［8］. 還需深入研究的是CLCA的胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制及與其他促進(jìn)因素的關(guān)系. </p><p><b>　　【參考文獻(xiàn)】 </b></p><p>　?。?］ Fahy JY. Goblet cell and mucin gene abnormalities in asthma ［J］. Chest, 2002; 122(6 Suppl)

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