鳳尾蕨屬6種藥用植物抗腫瘤有效部位篩選

1、<p>　　鳳尾蕨屬6種藥用植物抗腫瘤有效部位篩選</p><p>　　作者：龔先玲，茍占平，梁念慈，劉義，李立</p><p>　　【摘要】 目的對鳳尾蕨屬6種藥用植物抗腫瘤有效部位進(jìn)行篩選。方法采用MTT法對鳳尾蕨屬6種藥用植物不同溶劑萃取物進(jìn)行體外抗腫瘤活性測試。結(jié)果半邊旗的醋酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物;刺齒半邊旗的石油醚萃取物、醋酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物;井欄邊草的醋

2、酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物;劍葉鳳尾蕨的醋酸乙酯萃取物;線羽鳳尾蕨的正丁醇萃取物對人肺癌細(xì)胞A549增殖均有明顯的抑制作用。結(jié)論上述鳳尾蕨屬幾種藥用植物的萃取物具有較好的體外抗腫瘤活性，是其抗腫瘤作用的有效部位。 </p><p>　　【關(guān)鍵詞】 鳳尾蕨屬; 抗腫瘤作用; 有效部位</p><p>　　Abstract：ObjectiveTo screen the active frac

3、tion with antitumor effect from 6 medicinal plants of Pteris L..MethodsThe samples of the 6 plants were extracted with ethanol at first, and then the ethanol extracts were separated with petroleum ether, ethyl acetate, n

4、-Butyl alcohol in turn to get three fractions. Then the antitumor effect of the extracts were tested with MTT method.ResultsEthyl acetate and n-BuOH extracts of Pteris semipinnta L., petroleum ether, ethyl acetate and n-

5、BuOH extracts of </p><p>　　Key words：Pteris; Antitumor effect; Active fraction</p><p>　　半邊旗藥材為來源于鳳尾蕨屬植物半邊旗Pteris semipinnta L.的干燥全草[1]。從中分離到的二萜類化合物5F、6F和A具有抗腫瘤作用[2,3]，其中5F含量較高，但活性不是很強(qiáng)，6F和A活性很強(qiáng)，但

6、其在原植物中的含量太低而不能開發(fā)利用。2006年由我們申報，半邊旗藥材被廣東省食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)為廣東省地方藥材標(biāo)準(zhǔn)品種。根據(jù)藥用植物親緣學(xué)的原理，親緣關(guān)系相近的植物其所含化學(xué)成分相似，而化學(xué)結(jié)構(gòu)相似的化合物其生理活性多相似[4]，因此，我們在研究半邊旗抗腫瘤作用的基礎(chǔ)上，對與半邊旗同屬的其他5種藥用植物的抗腫瘤藥效部位進(jìn)行了篩選，以期發(fā)現(xiàn)抗腫瘤活性強(qiáng)的含量較高的二萜類化合物。</p><p><b&g

7、t;　　1 儀器與材料</b></p><p>　　1.1 儀器旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，AE-240天平;NAPCO series 5400 CO2培養(yǎng)箱，Elx 酶標(biāo)儀(Bio-TEK- INSTUMENTS INC產(chǎn)品);96孔培養(yǎng)板(美國Costar)。</p><p>　　1.2 材料乙醇、醋酸乙酯、正丁醇(分析純);小牛血清(杭州四季青生物材料有限公司);RPMI 1640培養(yǎng)基

8、(GIBCO);二甲基亞砜(DMSO)、5-氟尿嘧啶(5-Fu)、胰蛋白酶、甲基噻唑藍(lán)(MTT)(美國Sigma公司)。半邊旗Pteris semipinnta L.采于廣州市郊，刺齒半邊旗P. dispar Kze.、井欄邊草P. multifida Poir.、劍葉鳳尾蕨P. ensiformis Burm.、蜈蚣草P. vittata L.采于廣東湛江，線羽鳳尾蕨P. linearis L.采于廣東東莞，由廣東醫(yī)學(xué)院生藥學(xué)副教授茍

9、占平博士鑒定。人肺癌A549細(xì)胞株，由本實驗室傳代培養(yǎng)。</p><p><b>　　2 方法</b></p><p>　　2.1 實驗藥品的制備將采集的6種新鮮樣品半邊旗、刺齒半邊旗、井欄邊草、劍葉鳳尾蕨、蜈蚣草、線羽鳳尾蕨放于陰涼處晾干，粉碎。取上述6種粉碎的樣品各50 g，加乙醇500 ml，水浴回流提取2次，3 h/次，合并濾液，濾液減壓濃縮至干，浸膏加水溶解

10、，依次用石油醚(60～90℃)、醋酸乙酯、正丁醇萃取，將萃取物減壓濃縮至干，得到上述6種樣品的石油醚、醋酸乙酯、正丁醇干膏。以上18種干膏先用DMSO溶解，再加PBS溶解，精確配制成2400 μg·ml-1的儲存液(DMSO的體積分?jǐn)?shù)=1%)，過濾除菌，放4℃冰箱備用。</p><p>　　2.2 細(xì)胞培養(yǎng)人肺癌A549細(xì)胞培養(yǎng)于含10%小牛血清、100 kU·L-1 青霉素、100 mg&#

11、183;L-1 鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液中，在37℃、5% CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于實驗。</p><p>　　2.3 細(xì)胞增殖抑制試驗(MTT法) 取對數(shù)生長期的人肺癌細(xì)胞A549，用0.25%的胰蛋白酶消化，10% 新生小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)制成5×104個·ml-1的細(xì)胞懸液，接種于96孔板中，每孔接種100 μl。在37℃、5%、CO2條件下培

12、養(yǎng)過夜后，吸出培養(yǎng)液，加入新培養(yǎng)液180μl及藥液20 μl。待測樣品中DMSO終體積分?jǐn)?shù)=0.1%，干膏樣品的終濃度分別為30，60，120，240 μg·ml-1，每個濃度平行6孔;培養(yǎng)72 h后，每孔加入5 mg·ml-1的MTT 20 μl，37℃， 5% CO2條件下溫育4～ 6 h，棄去上清液，每孔加入150 μl DMSO，在微型振蕩器上搖勻15 min，結(jié)晶溶解后，立即比色，在酶標(biāo)儀主波長為570 n

13、m，參比波長為630 nm處測量OD值，比色以空白孔調(diào)零。抑制率(%)=(1-實驗組6孔OD值平均值/對照組6孔OD值平均值)×100%。</p><p>　　2.4 統(tǒng)計分析采用SPSS11.0。</p><p><b>　　3 結(jié)果</b></p><p>　　3.1 鳳尾蕨屬同一植物不同提取部位對A549腫瘤細(xì)胞生長增殖的影響&

14、lt;/p><p>　　3.1.1 半邊旗各提取部位對體外培養(yǎng)的A549腫瘤細(xì)胞生長增殖的影響 半邊旗各提取部位的體外抗腫瘤活性顯示(表1)，其石油醚提取物、醋酸乙酯提取物和正丁醇提取物在各個質(zhì)量濃度范圍對腫瘤細(xì)胞均有抑制作用;石油醚提取物對A549腫瘤細(xì)胞的增殖抑制有一定的劑量依賴性;而醋酸乙酯提取物和正丁醇提取物對A549腫瘤細(xì)胞的增殖抑制呈明顯的劑量依賴性，在240 μg·ml-1時抑制作用非常明顯，

15、抑制率分別為88.55%，61.72%。</p><p>　　表1 半邊旗各提取部位對體外培養(yǎng)的A549腫瘤細(xì)胞生長增殖的影響</p><p>　　3.1.2 刺齒半邊旗各提取部位對體外培養(yǎng)的A549腫瘤細(xì)胞生長增殖的影響刺齒半邊旗各提取部位的體外抗腫瘤活性顯示(表2)，石油醚提取物、醋酸乙酯提取物和正丁醇提取物在各個質(zhì)量濃度范圍對A549腫瘤細(xì)胞都有較強(qiáng)的抑制作用，在240 μg

16、3;ml-1時的抑制率分別為57.87%，77.15%，84.61%;且有明顯的劑量依賴性。</p><p>　　3.1.3 井欄邊草各提取部位對體外培養(yǎng)的A549腫瘤細(xì)胞生長增殖的影響井欄邊草各提取部位的體外抗腫瘤活性顯示(表3)，石油醚提取物、醋酸乙酯提取物和正丁醇提取物在各個質(zhì)量濃度范圍對腫瘤細(xì)胞均有抑制作用;醋酸乙酯提取物和正丁醇提取物在濃度為240 μg·ml-1時，對A549腫瘤細(xì)胞有明顯的

17、抑制作用，抑制率分別為65.06%和82.13%。</p><p>　　表2 刺齒半邊旗各提取部位對體外培養(yǎng)的A549腫瘤細(xì)胞生長增殖的影響</p><p>　　表3 井欄邊草各提取部位對體外培養(yǎng)的A549腫瘤細(xì)胞生長增殖的影響</p><p>　　3.1.4 劍葉鳳尾蕨各提取部位對體外培養(yǎng)的A549腫瘤細(xì)胞生長增殖的影響劍葉鳳尾蕨各提取部位的體外抗腫瘤活性顯示(表

18、4)，240 μg·ml-1的醋酸乙酯提取物對A549腫瘤細(xì)胞有較強(qiáng)的抑制作用，而此濃度的正丁醇提取物對A549腫瘤細(xì)胞的抑制率為15.25%，該濃度的石油醚提取物對A549腫瘤細(xì)胞的抑制作用僅為8.74%。</p><p>　　表4 劍葉鳳尾蕨各提取部位對體外培養(yǎng)的A549腫瘤細(xì)胞生長增殖的影響</p><p>　　3.1.5 蜈蚣草各提取部位對體外培養(yǎng)的A549腫瘤細(xì)胞生長增

19、殖的影響蜈蚣草各提取部位的體外抗腫瘤活性顯示(表5)，各提取部位對A549腫瘤細(xì)胞的抑制作用都較弱，石油醚提取物、醋酸乙酯提取物和正丁醇提取物在240 μg·ml-1時，對A549腫瘤細(xì)胞的抑制率分別為24.60%，22.76%，14.29%。</p><p>　　表5 蜈蚣草各提取部位對體外培養(yǎng)的A549腫瘤細(xì)胞生長增殖的影響</p><p>　　3.1.6 線羽鳳尾蕨各提取部

20、位對體外培養(yǎng)的A549腫瘤細(xì)胞生長增殖的影響 線羽鳳尾蕨各提取部位的體外抗腫瘤活性顯示(表6)，其正丁醇萃取物對A549腫瘤細(xì)胞有較強(qiáng)的抑制作用，且呈一定的劑量依賴性;醋酸乙酯提取物對A549腫瘤細(xì)胞的抑制作用較弱，而石油醚提取物對A549腫瘤細(xì)胞的增殖在低濃度時有一定的促進(jìn)作用，在240 μg·ml-1時的抑制率僅為2.49%。</p><p>　　表6 線羽鳳尾蕨各提取部位對體外培養(yǎng)的A549腫瘤細(xì)

21、胞生長增殖的影響</p><p>　　3.2 鳳尾蕨屬6種植物同一提取部位對A549細(xì)胞增殖影響的比較見圖1～3。</p><p>　　圖1 鳳尾蕨屬6種植物石油醚萃取部位對A549細(xì)胞增殖的影響</p><p>　　從圖1可以看出，當(dāng)藥物濃度為240μg·ml-1時刺齒半邊旗石油醚萃取物對A549細(xì)胞的增殖抑制作用最強(qiáng)，超過55%，依次為蜈蚣草石油醚萃取

22、物(抑制率近25%)，半邊旗石油醚萃取物(抑制率15%左右)，其余3種植物的該部位萃取物A549細(xì)胞的抑制作用更低，幾乎都在10%以下。</p><p>　　從圖2可以看出，當(dāng)藥物濃度為240μg·ml-1時，半邊旗醋酸乙酯萃取物對A549細(xì)胞的增殖抑制作用最強(qiáng)，其次為刺齒半邊旗醋酸乙酯萃取物，井欄邊草醋酸乙酯萃取物，劍葉鳳尾蕨醋酸乙酯萃取物，蜈蚣草醋酸乙酯萃取物，線羽鳳尾蕨醋酸乙酯萃取物，最后兩種的醋

23、酸乙酯萃取部位對A549細(xì)胞的抑制作用較低，在20%左右，其余幾種的該部位對A549細(xì)胞的抑制率均高于50%。</p><p>　　圖2 鳳尾蕨屬6種植物醋酸乙酯萃取部位對A549細(xì)胞增殖的影響</p><p>　　圖3 鳳尾蕨屬6種植物正丁醇萃取部位對A549細(xì)胞增殖的影響</p><p>　　從圖3可以看出，當(dāng)藥物濃度為240μg·ml-1時刺齒半邊旗

24、正丁醇萃取物對A549細(xì)胞的增殖抑制作用最強(qiáng)，其次為井欄邊草正丁醇萃取物，線羽鳳尾蕨正丁醇萃取物和半邊旗正丁醇萃取物，它們對A549細(xì)胞的抑制率均高于60%，而劍葉鳳尾蕨正丁醇萃取物和蜈蚣草正丁醇萃取物在該濃度時對A549細(xì)胞的抑制率均在15%左右。</p><p><b>　　4 討論</b></p><p>　　半邊旗具有較強(qiáng)的抗腫瘤作用，本實驗在研究半邊旗抗腫瘤

25、作用的基礎(chǔ)上，以人肺癌細(xì)胞A549為篩選模型，以抗腫瘤活性為指標(biāo)，較系統(tǒng)地對鳳尾蕨屬6種藥用植物不同提取部位進(jìn)行了抗腫瘤活性的初步篩選。結(jié)果表明，半邊旗中抗腫瘤作用的物質(zhì)存在于醋酸乙酯部位、正丁醇部位，這與我們前面的篩選研究結(jié)果一致[5];刺齒半邊旗的抗腫瘤作用部位存在于石油醚部位、醋酸乙酯部位、正丁醇部位;井欄邊草中抗腫瘤作用的物質(zhì)存在于醋酸乙酯部位、正丁醇部位;劍葉鳳尾蕨中抗腫瘤作用的物質(zhì)存在于醋酸乙酯部位;線羽鳳尾蕨中抗腫瘤作用的

26、物質(zhì)存在于正丁醇部位;其他部位對A549細(xì)胞增殖抑制作用不明顯。值得注意的是，刺齒半邊旗石油醚萃取物在濃度為240μg·ml-1時其抑制率接近60%，而半邊旗石油醚萃取物在相應(yīng)濃度時其抑制率僅為15.12%;刺齒半邊旗醋酸乙酯萃取物在濃度為60μg·ml-1時其抑制率已超過50%，在濃度為120μg·ml-1時其抑制率已接近70%，而半邊旗醋酸乙酯萃取物在相應(yīng)濃度時其抑制率僅分別為19.92%和35.67%

27、;刺齒半邊旗正丁醇萃取物在濃度為60μg·ml-1時其抑制率已超過70%，井欄邊草正丁醇萃取物在濃</p><p>　　本課題組雖然對半邊旗中的抗腫瘤二萜類活性成分5F進(jìn)行了深入的研究，但對其所含抗腫瘤活性比5F更強(qiáng)的6F和A卻由于含量低的原因未能進(jìn)一步開發(fā)研究。本實驗的目的是確定與半邊旗同屬的其他植物的抗腫瘤活性部位，為下一步在活性作用的指導(dǎo)下，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)抗腫瘤作用比5F更強(qiáng)的含量較高的二萜類化合物提

28、供研究基礎(chǔ)。</p><p><b>　　【參考文獻(xiàn)】</b></p><p>　　[1] 王玉生，蔡樂文. 南方藥用植物圖鑒[M]. 汕頭：汕頭大學(xué)出版社，2005：18.</p><p>　　[2] 張 曉，李金華，何承偉，等.半邊旗中二萜類化合物的植化及抗腫瘤活性初步研究[J].中國藥學(xué)雜志，1999，34(8)：512.</p&g

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