菊科與黃連屬藥用植物的RAPD指紋分析.pdf

1、本文以菊科與黃連屬的部分藥用植物為材料，通過RAPD(Random AmplifiedPolymorphic DNA)技術(shù)在菊科藥用植物的聚類關(guān)系、黃連屬植物的RAPD反應(yīng)體系與反應(yīng)條件優(yōu)化、遺傳多樣性分析以及將RAPD標(biāo)記轉(zhuǎn)化為SCAR(SequenceCharacterized Amplified Region)標(biāo)記四個(gè)方面進(jìn)行了研究，主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：
　　 1.利用RAPD技術(shù)對(duì)七種菊科藥用植物的遺傳多樣性及親緣關(guān)系進(jìn)行

2、了分析。從50條10 bp隨機(jī)引物中篩選出10個(gè)多態(tài)性好的引物進(jìn)行RAPD擴(kuò)增，擴(kuò)增DNA片段數(shù)據(jù)用UPGMA聚類法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。10條引物共擴(kuò)增出337條帶，多態(tài)性帶337條。聚類結(jié)果顯示RAPD分子標(biāo)記構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹在族內(nèi)屬間與傳統(tǒng)分類系統(tǒng)一致。
　　 2.以三種黃連屬植物(中國(guó)黃連、三角葉黃連、峨眉野連)為材料提取其基因組，以峨眉黃連基因組為模板DNA，利用10 bp隨機(jī)引物進(jìn)行黃連RAPD-PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件的

3、優(yōu)化，并進(jìn)行了DNA聚合酶的篩選；進(jìn)一步以3引物1模板與1引物2模板組合來探討引入TD-PCR(Touch Down PCR)技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)。結(jié)果表明在25μlRAPD-PCR反應(yīng)體系中，引物、模板、dNTPs濃度分別為0.32μmol/L、0.40 mg/L、0.25mmol/L，DNA聚合酶選取PyrobestTM DNA聚合酶且用量為1U，反應(yīng)程序?yàn)?4℃2'；94℃50s，39℃1，72℃1'；退火溫度-0.5/cycle，至36.

4、5℃；94℃50s，36℃1，72℃1，33cycles；72℃3'時(shí)，黃連RAPD-PCR可獲得特異性高、重復(fù)性好、穩(wěn)定性強(qiáng)的標(biāo)記。
　　 3.利用上述優(yōu)化的RAPD反應(yīng)體系與反應(yīng)條件對(duì)黃連屬三個(gè)物種——中國(guó)黃連、三角葉黃連和峨眉野連的基因組進(jìn)行擴(kuò)增，34種引物針對(duì)黃連屬10個(gè)模板的擴(kuò)增條帶為528，多態(tài)性條帶比例為86.36％，峨眉野連為325，多態(tài)條帶比例為34.15％。隨機(jī)引物S55擴(kuò)增的10個(gè)黃連模板的RAPD圖譜可將

5、黃連屬三個(gè)物種(中國(guó)黃連、三角葉黃連、峨眉野連)區(qū)別開來。種間是兩個(gè)生境的三角葉黃連相似性較高而聚在一起，所有的峨眉野連聚在一支，且中國(guó)黃連與三角葉黃連相對(duì)其與峨眉野連的相似度要高；峨眉野連的聚類是采集于黃灣茶地的鳳尾型與雙翼型峨眉野連聚為一支，白崖、三道河與人棚子溝三個(gè)采集點(diǎn)的峨眉野連聚為一支，聚類結(jié)果與峨眉野連的棲息地生態(tài)環(huán)境相一致。
　　 4.選取僅出現(xiàn)在三道河的兩種表型(風(fēng)尾型和雙翼型)峨眉野連和黃灣茶地的風(fēng)尾型峨眉野連