硫黃菌多糖的提取與紅外譜測(cè)定畢業(yè)論文

1、<p><b>　　目錄</b></p><p><b>　　摘要:4</b></p><p>　　1.真菌多糖的研究5</p><p>　　1.1 真菌多糖研究概況5</p><p>　　1.2 真菌多糖的生物活性6</p><p>　　1.2.1多糖的免

2、疫調(diào)節(jié)作用6</p><p>　　1.2.2 抗氧化作用6</p><p>　　1.2.3 抗?jié)冏饔?</p><p>　　2.實(shí)驗(yàn)操作與方法6</p><p>　　2.1 硫黃菌粗多糖的提取6</p><p>　　2.1.1實(shí)驗(yàn)藥品與儀器6</p><p>　　2.1.2 儀器的

3、使用7</p><p>　　2.1.2.1 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器的使用7</p><p>　　2.1.2.1.1 工作原理7</p><p>　　2.1.2.1.2 操作方法7</p><p>　　2.1.2.2循環(huán)水真空泵的使用7</p><p>　　2.1.2.2.1水循環(huán)式真空泵工作原理7</p>

4、<p>　　2.1.2.2.2循環(huán)水真空泵的使用方法7</p><p>　　2.1.3 實(shí)驗(yàn)操作7</p><p>　　2.1.3.1 硫黃菌多糖的粗提取7</p><p>　　2.1.3.2 濾液濃縮7</p><p>　　2.1.3.3 粗多糖的制備8</p><p><b>　　2

5、.2除蛋白質(zhì)8</b></p><p>　　2.2.1 材料、藥品與儀器8</p><p>　　2.2.1.1 實(shí)驗(yàn)材料8</p><p>　　2.2.1.2 藥品與儀器8</p><p>　　2.2.2 實(shí)驗(yàn)操作8</p><p>　　2.3 硫黃菌多糖的純化8</p><

6、p>　　2.3.1 藥品與儀器8</p><p>　　2.3.1.1 藥品8</p><p>　　2.3.1.2 儀器8</p><p>　　2.3.2 藥品的配制4</p><p>　　2.3.2.1 NaCl溶液的配制8</p><p>　　2.3.2.2 苯酚溶液的配制8</p>

7、<p>　　2.3.2.3 0.5mol∕L NaOH溶液的配制9</p><p>　　2.3.2.4 HCl溶液的配制9</p><p>　　2.3.3 離子交換柱的分離原理9</p><p>　　2.3.4 分離柱的活化9</p><p>　　2.3.5 裝柱9</p><p>　　2.3.6

8、 多糖的純化9</p><p>　　2.3.7 多糖的檢測(cè)10</p><p>　　2.3.7.1 檢測(cè)的原理10</p><p>　　2.3.7.2 實(shí)驗(yàn)操作10</p><p>　　2.3.8再濃縮10</p><p>　　2.3.9透析10</p><p>　　3.結(jié)果與討論

9、10</p><p>　　3.1硫黃菌粗多糖的制備10</p><p>　　3.2 硫酸-苯酚法檢測(cè)硫黃菌多糖10</p><p>　　3.3 采用DEAE纖維素交換柱純化硫黃菌多糖。10</p><p>　　3.4硫黃菌多糖的紅外譜測(cè)定11</p><p><b>　　4 .結(jié)論12</b&

10、gt;</p><p><b>　　5.參考文獻(xiàn)12</b></p><p><b>　　致謝13</b></p><p>　　硫黃菌多糖的提取與紅外譜測(cè)定</p><p>　　生命科學(xué)學(xué)院生物技術(shù)專業(yè)2013級(jí) 指導(dǎo)教師： </p><p>　　摘 要:食藥用真菌多糖

11、在國(guó)際上被稱為“ 生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑”, 簡(jiǎn)稱 BRM, 作為一種生物非特異性免疫促進(jìn)劑,具有抗腫瘤、抗病毒、降血脂、促進(jìn)核酸和蛋白質(zhì)生物合成等多種生物功效。硫黃菌是一種常見(jiàn)的食用和藥用價(jià)值都很高的真菌；隨著藥用真菌多糖研究的不斷深入和發(fā)展,發(fā)現(xiàn)硫磺菌多糖具有抗病毒、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性，是一種純天然無(wú)毒副作用的成分。但關(guān)于硫黃菌多糖的提取和成分的檢測(cè)卻很少，本實(shí)驗(yàn)以硫黃菌為原料,系統(tǒng)地研究了硫黃菌多糖的分離純化技術(shù),對(duì)純化后所得

12、的多糖的理化性質(zhì)和單糖組成進(jìn)行了初步探討。以硫黃菌子實(shí)體為材料，采用水浸提多糖，醇沉浸提濃縮液，乙醇除蛋白，DEAE-52離子交換純化多糖，再濃縮、透析的方法，獲得了硫黃菌多糖，并經(jīng)硫酸-苯酚法檢測(cè)，且與對(duì)照組比較，呈較明顯的多糖陽(yáng)性顯色反應(yīng)，其顏色的變化與含量呈正相關(guān)。硫黃菌多糖在掃描電鏡下顯示為針狀結(jié)晶，晶體規(guī)整，透明度高。紅外譜顯示其在3416.00 cm-1、2928.00 cm-1等處有明顯多糖特征峰出現(xiàn)，且成分單一，無(wú)其他結(jié)

13、構(gòu)特征峰，表明該多糖為一種純品多糖，該研究結(jié)果為其結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步確定和活性的研究奠定了基礎(chǔ)。</p><p>　　關(guān)鍵詞：硫黃菌；多糖；提取紅外譜</p><p>　　The extraction of Polysaccharide from sulfur and infrared spectroscopy</p><p>　　College of Life Scie

14、nce Grade 2013 Instructor: </p><p>　　Abstract: The polysaccharides from edible and medicinal fungi in the world known as the "biological response modifiers", referred to as BRM, as a kind of biolog

15、ical nonspecific immune enhancer, anti-tumor, antiviral, hypolipidemic, promote the biosynthesis of nucleic acid and protein and other biological effects. Sulfur fungi is a kind of common edible and medicinal value is ve

16、ry high fungi; with the deepening of the study of medicinal fungi polysaccharides and development, found that sulfur fun</p><p>　　Key words: Sulfur fungus; polysaccharide;extraction;infrared spectrum</p&g

17、t;<p><b>　　前言</b></p><p>　　迄今為止，人類對(duì)核酸和蛋白質(zhì)的研究取得了重大進(jìn)展，推動(dòng)了生命科學(xué)及相關(guān)科學(xué)領(lǐng)域發(fā)展，多糖將成為最后一類有待攻破的生物活性大分子。多糖的來(lái)源大致分為植物來(lái)源多糖、動(dòng)物來(lái)源多糖和微生物來(lái)源多糖，真菌多糖即真菌產(chǎn)生的多糖。</p><p>　　多糖是由單糖組成的天然高分子化合物，廣泛存在于植物、動(dòng)物和微

18、生物組織中。真菌多糖是從真菌子實(shí)體、菌絲體、發(fā)酵液中分離出的,可以控制細(xì)胞分裂分化，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)衰老的一類活性多糖。經(jīng)研究表明，多糖具有生物反應(yīng)調(diào)節(jié)物的特征，可作為免疫增強(qiáng)劑和免疫激活劑; 此外，它還具有抗細(xì)菌、抗病毒和抗凝聚的作用，提高肝功能和解毒力，提高動(dòng)物耐缺氧能力和氧的利用率，降低血液的粘稠度，增加心肌收縮力，改善心律，降血糖、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、平喘、止咳、化痰的功效。因此，對(duì)真菌多糖的成分進(jìn)行進(jìn)一步研究和測(cè)定具有重要的意義。<

19、/p><p><b>　　1 真菌多糖的研究</b></p><p>　　1.1 真菌多糖研究概況</p><p>　　糖類的生命科學(xué)幾乎與蛋白質(zhì)的生命科學(xué)同時(shí)誕生；但是糖類研究遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于蛋白質(zhì)和核酸的研究。多糖廣泛存在于動(dòng)物細(xì)胞膜，植物和微生物細(xì)胞壁中,是一類天然高分子化合物。它是由醛糖或酮糖通過(guò)糖苷鍵連接在一起的多聚物，是構(gòu)成生命的四大基本物質(zhì)

20、之一。真菌多糖的科學(xué)研究始于20世紀(jì)50年代末對(duì)真菌多糖抗癌效果的發(fā)現(xiàn)；隨著對(duì)多糖結(jié)構(gòu)的逐步深入了解，多糖化合物的生物活性研究得以迅速發(fā)展；研究對(duì)象包括真菌類、地衣類和植物花粉研究，范圍涉及多糖的分離純化、結(jié)構(gòu)分析、理化性質(zhì)以及臨床應(yīng)用等[1]。尤其對(duì)多糖免疫增強(qiáng)作用機(jī)制的研究已深入到分子和受體水平。</p><p>　　真菌多糖是從真菌子實(shí)體、菌絲體、發(fā)酵液中分離出的可以控制細(xì)胞分裂分化和調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)衰老的一類

21、活性多糖。真菌多糖具有很強(qiáng)烈的抗腫瘤活性，對(duì)癌細(xì)胞有很強(qiáng)的抑制力。當(dāng)前，對(duì)真菌多糖的研究主要包括兩方面；一是真菌多糖的提取純化及結(jié)構(gòu)分析；二是利用一些免疫指標(biāo)分析其生物活性及免疫機(jī)理。</p><p>　　1.2 真菌多糖的生物活性</p><p>　　近年來(lái)在多糖化合物的研究中發(fā)現(xiàn)來(lái)自真菌的多糖化合物具有很強(qiáng)的生物活性；如具有調(diào)節(jié)免疫功能及抗腫瘤作用。近50年來(lái)已有大量關(guān)于真菌多糖生物活

22、性的研究報(bào)道，主要集中在免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗?jié)兊确矫妗?lt;/p><p>　　1.2.1 多糖的免疫調(diào)節(jié)作用</p><p>　　多糖不僅能激活巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和殺傷細(xì)胞等免疫細(xì)胞。還能促進(jìn)細(xì)胞因子生成活化補(bǔ)體，從而在抗腫瘤、抗病毒、抗感染以及抗衰老等的防治上具有獨(dú)特的功效。龔曉健等研究了人工蟲草胞內(nèi)與胞外多糖對(duì)非特異性免役功能的影響，結(jié)果表明人工蟲草胞內(nèi)與胞外多糖能顯著地

23、增加細(xì)胞的吞噬指數(shù)并增強(qiáng)單核巨噬細(xì)胞的吞噬功能；此外，胞內(nèi)多糖能顯著地增加小鼠耳朵的腫脹度并且提高提高溶血水平。</p><p>　　1.2.2 抗氧化作用</p><p>　　已發(fā)現(xiàn)許多真菌多糖具有清除自由基，提高抗氧化酶活性和抑制脂質(zhì)過(guò)氧化的活性，起到保護(hù)生物膜和延緩衰老的作用[2]。實(shí)驗(yàn)證明,從長(zhǎng)白山野生云芝中提取的彩云多糖給受射線全身照射的小鼠能使多種臟器和細(xì)胞內(nèi)SOD活力升高，并

24、使脂質(zhì)過(guò)氧化物水平下降。</p><p>　　1.2.3 抗?jié)冏饔?lt;/p><p>　　通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明:人參果膠、糊精等都有利于不同程度的降低胃酸和抑制胃蛋白酶活性的作用。從制備鹿茸精廢渣里獲得的多糖中發(fā)現(xiàn)其有降低胃酸，抑制胃蛋白酶活性和升高胃液PGE2水平的作用。</p><p><b>　　2 實(shí)驗(yàn)操作與方法</b></p>

25、<p>　　2.1 硫黃菌粗多糖的提取</p><p>　　2.1.1 實(shí)驗(yàn)藥品與儀器</p><p>　　超凈水、無(wú)水乙醇、漏斗、玻璃棒、燒杯、紗布、中興牌FZ102粉碎機(jī)、上海亞榮RE6000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、亞榮SHZ-Ⅲ循環(huán)水真空泵、JA1003電子天平、YaRong RE-86水浴鍋、透析袋，恒溫烘箱、酶標(biāo)儀。</p><p>　　2.1.2 儀器的使

26、用</p><p>　　2.1.2.1 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器的使用</p><p>　　2.1.2.1.1 工作原理</p><p>　　在真空條件下，恒溫加熱，使旋轉(zhuǎn)瓶恒速旋轉(zhuǎn)，樣品在瓶壁形成大面積薄膜，高效蒸發(fā)。蒸氣經(jīng)高效玻璃冷凝器冷卻，回收于收集瓶中，大大提高蒸發(fā)效率。特別適用于對(duì)高溫容易分解變性的生物制品的濃縮提純。</p><p>　　2.1

27、.2.1.2操作方法</p><p>　　將上好樣的玻璃球與儀器連接好，向不銹鋼鍋里加入適量的水，調(diào)節(jié)升降按鈕將不銹鋼鍋調(diào)到合適高度；打開(kāi)旋轉(zhuǎn)按鈕，檢查儀器是否連接完好，將鍋升打開(kāi)電源開(kāi)關(guān)，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)數(shù)為40rpm,溫度設(shè)置為90℃。使用完畢，先將轉(zhuǎn)數(shù)調(diào)節(jié)到“0”，再關(guān)閉電源。</p><p>　　2.1.2.2 循環(huán)水真空泵的使用</p><p>　　2.1.2.2.

28、1 水循環(huán)式真空泵工作原理</p><p>　　在泵體中裝有適量的水作為工作液。當(dāng)葉輪順時(shí)針?lè)较蛐D(zhuǎn)時(shí)，水被葉輪拋向四周，由于離心力的作用，水形成了一個(gè)決定于泵腔形狀的近似于等厚度的封閉圓環(huán)。水環(huán)的下部分內(nèi)表面恰好與葉輪輪轂相切，水環(huán)的上部?jī)?nèi)表面剛好與葉片頂端接觸。此時(shí)葉輪輪轂與水環(huán)之間形成一個(gè)月牙形空間，而這一空間又被葉輪分成和葉片數(shù)目相等的若干個(gè)小腔。如果以葉輪的下部0°為起點(diǎn)，那么葉輪在旋轉(zhuǎn)前18

29、0°時(shí)小腔的容積由小變大，且與端面上的吸氣口相通，此時(shí)氣體被吸入，當(dāng)吸氣終了時(shí)小腔則與吸氣口隔絕；當(dāng)葉輪繼續(xù)旋轉(zhuǎn)時(shí)，小腔由大變小，使氣體被壓縮；當(dāng)小腔與排氣口相通時(shí)，氣體便被排出泵外。</p><p>　　2.1.2.2.2 循環(huán)水真空泵的使用方法</p><p>　　使用之前應(yīng)先檢查電壓正常、不超過(guò)額定電壓（380V）±5%、電氣開(kāi)關(guān)和設(shè)備接地線正常、泵各部件連結(jié)是否

30、可靠、各部位潤(rùn)滑油是否足夠、真空度調(diào)節(jié)閥應(yīng)調(diào)整至合適的開(kāi)度。使用時(shí)，先打開(kāi)冷凝水，關(guān)閉旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器排氣閥，打開(kāi)真空泵開(kāi)關(guān)，打開(kāi)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器電源，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)數(shù)。關(guān)閉時(shí)，先打開(kāi)排氣閥，直至氣壓回歸為零，再關(guān)閉真空泵電源開(kāi)關(guān)。</p><p>　　2.1.3 實(shí)驗(yàn)操作</p><p>　　2.1.3.1 硫黃菌多糖的粗提取</p><p>　　將經(jīng)過(guò)粉碎的硫黃菌粉料投入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器

31、的浸提器中，加20倍量的超凈水，攪拌，混合均勻，將儀器溫度設(shè)置為90℃，蒸煮6h。蒸煮完畢，將料液離心，以4000r／min離心5min，收集殘?jiān)硇芯C合利用，按上述操作循環(huán)兩次，將三次蒸煮離心后的上清液合并收集；待用。</p><p>　　2.1.3.2 濾液濃縮</p><p>　　第一次蒸煮的上清液大概有3000ml,為了節(jié)約試劑的用量，我們需將上清液進(jìn)行濃縮，將上清液添加到旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)

32、器的圓瓶?jī)?nèi)，將上清液進(jìn)行濃縮。溫度不超過(guò)60℃，轉(zhuǎn)數(shù)40rpm左右，濃縮直至黏稠的程度即可，靜置過(guò)夜；待用。</p><p>　　2.1.3.3 粗多糖的制備</p><p>　　采用醇沉法，用無(wú)水乙醇沉淀，主要成分是蛋白質(zhì)和多糖。以4:1的比例加入無(wú)水乙醇和濃縮液，用玻璃棒輕輕攪拌，直至料液中乙醇濃度達(dá)到70%～80%（V/V）位置，靜置；讓醇沉完全。將料液分裝后放入離心機(jī)，以10000

33、r／min離心5min?；厥找掖?，得到的醇沉物為硫黃菌多糖，待用。</p><p>　　將上清液和醇沉物分別收集好，以備后續(xù)工作使用。雖然大多數(shù)多糖都以糖蛋白的形式存在于沉淀物中，但還有少量的糖游離存在于乙醇中。將乙醇液體進(jìn)行濃縮可以得到比較純的硫黃菌多糖。將濃縮后的粗多糖液靜置過(guò)夜。</p><p><b>　　2.2 除蛋白質(zhì)</b></p><

34、;p>　　2.2.1 材料、藥品與儀器</p><p>　　2.2.1.1 實(shí)驗(yàn)材料</p><p><b>　　沉淀的水溶物</b></p><p>　　2.2.1.2 藥品與儀器</p><p>　　乙醇、正丁醇、鐵架臺(tái)、萃取瓶、玻璃棒、燒杯等。</p><p>　　2.2.2 實(shí)驗(yàn)操作

35、</p><p>　　經(jīng)典的除蛋白質(zhì)的方法是用乙醇處理，按三分之一體積加入乙醇，混合振蕩均勻，同時(shí)用玻璃棒攪拌，在攪拌的過(guò)程中會(huì)有絮狀沉淀析出，把這些絮狀沉淀收集，置于烘箱中烘干。乙醇液冷凍處理，把烘干的樣品溶解于蒸餾水，離心后棄沉淀，將剩余的上清液濃縮，得到粗多糖。</p><p>　　2.3 硫黃菌多糖的純化</p><p>　　2.3.1 藥品與儀器</

36、p><p>　　2.3.1.1 藥品</p><p>　　需配制濃度為0.1-0.5mol/L梯度濃度的NaCl溶液、苯酚、DEAE纖維素、濃硫酸、NaOH顆粒、HCl溶液。</p><p>　　2.3.1.2 儀器</p><p>　　鐵架臺(tái)、10ml量程的移液槍、柱子、玻璃棒、漏斗、紗布、試管、燒杯、稱量紙、勺子、三角瓶、PH試紙、滴管。&l

37、t;/p><p>　　2.3.2 藥品的配制</p><p>　　2.3.2.1 NaCl溶液的配制</p><p>　　0.1mol/L、0.2mol/L、0.3mol/L、0.4mol/L、0.5mol/LNaCl溶液的配制:分別準(zhǔn)確稱取5.85g、11.7g、17.55g、23.4g、29.25g的NaCl固體，加1000ml的超凈水溶解即可。</p>

38、<p>　　2.3.2.2 苯酚溶液的配制</p><p>　　我們所用的苯酚濃度為1.0mol/L的濃度，準(zhǔn)確稱取苯酚固體9.4g,加100ml的超凈水溶解。注意：一般苯酚我們是現(xiàn)配現(xiàn)用，因?yàn)楸椒訕O易被氧化。</p><p>　　2.3.2.3 0.5mol∕L NaOH溶液的配制</p><p>　　準(zhǔn)確稱量NaOH固體20g，用1000ml的超凈

39、水溶解NaOH溶液，很容易與空氣中的CO2反應(yīng)，所用也是現(xiàn)配現(xiàn)用。</p><p>　　2.3.2.4 HCl溶液的配制</p><p>　　所用母液為濃HCl溶液，需將其稀釋為濃度為0.5mol/L的HCl溶液，具體操作如下：配制1L的HCl溶液所需濃HCl的體積為41.5ml，然后加純凈水稀釋就得到1L的0.5mol/L的HCl溶液。</p><p>　　2.3

40、.3 離子交換柱的分離原理</p><p>　　離子交換層析根據(jù)分子量的不同、電荷的性質(zhì)及電荷量的不同；常用的交換劑有DEAE-纖維素、 DEAE-葡聚糖和 DEAE-瓊脂糖等，此法適合于分離各種酸性多糖、中性多糖和黏多糖。</p><p>　　本次試驗(yàn)采用DEAE纖維素交換劑，其分離原理是：多糖在一般情況下帶負(fù)電，DEAE纖維素所裝的柱子是屬于陰離子交換柱，在使用交換柱的時(shí)候應(yīng)先將其活化

41、，使柱子結(jié)合上氫氧根離子，在上樣后，多糖離子會(huì)將氫氧根離子置換下來(lái)，這樣多糖就被吸附上去，然后我們用不同濃度梯度的NaCl溶液將其洗脫下來(lái)，即得到我們想要的多糖，而蛋白質(zhì)及其他的成分不能出柱。</p><p>　　2.3.4 分離柱的活化</p><p>　　先用所配制的NaOH(0.5mol/L)溶液浸泡纖維素，大約三小時(shí)；然后再用配HCl(0.5mol/L)溶液浸泡，時(shí)間一樣；最后再用

42、NaOH(0.5mol/L)溶液浸泡三時(shí)?；罨螅覀儜?yīng)將纖維素調(diào)至中性，即用超凈水浸泡，用PH試紙檢測(cè)PH，反復(fù)如此直至PH試紙顯示成中性即可。</p><p><b>　　2.3.5 裝柱</b></p><p>　　用鐵架臺(tái)將柱子固定好，保持豎直，不能傾斜。將活化好的柱填料，輕輕地倒入柱內(nèi)。柱子不宜過(guò)高，一般5cm即能滿足實(shí)驗(yàn)要求。如果柱子太高，會(huì)造成擴(kuò)散誤差，

43、使分離效果不好。裝好柱子后，加滿超凈水，壓柱。用玻璃棒將纖維素?cái)嚢杈鶆?，力度不能過(guò)大，直至柱內(nèi)無(wú)氣泡，而且柱面要平。如果柱內(nèi)有氣泡，會(huì)直接影響分離。</p><p>　　2.3.6 多糖的純化</p><p>　　在加樣之前，準(zhǔn)備好數(shù)個(gè)干凈的三角瓶。用移液槍準(zhǔn)確吸取醇沉濃縮后粗多糖溶液5ml，然后沿著管壁輕輕地旋轉(zhuǎn)加入，速度不能太快，否則會(huì)使柱平面產(chǎn)生凹陷，影響分離效果[3]。加樣完畢之后

44、，由于糖的黏度太大，走柱子走的很慢，可以加純凈水，使之產(chǎn)生壓力，使柱子走的更快些。當(dāng)加的超凈水走完之后，用不同的濃度梯度的NaCl溶液洗脫，每次都加一柱子的量。在柱子下面用三角瓶接，每50ml換一次三角瓶。</p><p>　　2.3.7 多糖的檢測(cè)</p><p>　　2.3.7.1 檢測(cè)的原理</p><p>　　常用的多糖的檢測(cè)方法有：硫酸苯酚法、硫酸蒽酮法、

45、碘量法、高效液相色譜法[4]。</p><p>　　本次實(shí)驗(yàn)采用的是硫酸苯酚法，其原理是：多糖在強(qiáng)酸條件下水解為單糖分子， 再在沸水浴中脫水生成羥甲基糖醛，然后與苯酚縮合成磚紅色化合物，在一定范圍內(nèi)顏色深淺與糖含量成正比[5]。</p><p>　　2.3.7.2 實(shí)驗(yàn)操作</p><p>　　設(shè)一個(gè)對(duì)照，對(duì)照組用超凈水代替多糖溶液。</p><

46、p>　　用移液槍取多糖溶液2ml于試管中，向試管內(nèi)輕輕地加大概一滴管的濃硫酸，最后加數(shù)滴配好的苯酚溶液，輕輕振蕩。將過(guò)柱的液體每管取200uL加入到酶標(biāo)儀的上樣板中，調(diào)節(jié)紫外光的波長(zhǎng)，將其設(shè)置為490nm。測(cè)定其中多糖的含量。 </p><p><b>　　2.3.8 再濃縮</b></p><p>　　將分離后檢測(cè)有多糖的同一濃度梯度洗脫液洗脫出多糖的錐形瓶收

47、集在一起進(jìn)行濃縮，以備后用。</p><p><b>　　2.3.9 透析</b></p><p>　　為除低聚糖、氨基酸等小分子物質(zhì)，把硫黃菌粗多糖濃縮液裝入透析設(shè)備的透析袋中，用去離子水透析兩天，用半透膜逆向流水透析可除去低聚糖、單糖、氨基酸、鹽類離子等小分子雜質(zhì)。透析處理完畢后，取出透析內(nèi)液，待用。</p><p>　　2.3.10 紅外

48、光譜測(cè)定</p><p>　　取硫黃菌多糖樣品2mg左右，KBr壓片，紅外分光光度計(jì)調(diào)至4000cm-1-400cm-1來(lái)對(duì)其進(jìn)行測(cè)定。</p><p><b>　　3 結(jié)果與討論</b></p><p>　　3.1 硫黃菌粗多糖的制備</p><p>　　采用醇沉法，用無(wú)水乙醇沉淀蛋白質(zhì)和多糖，乙醇溶液中仍有少量游離多

49、糖，將乙醇液體進(jìn)行濃縮可以得到比較純的硫黃菌多糖，將濃縮后的粗多糖液靜置過(guò)夜，出現(xiàn)塊狀晶體。</p><p>　　3.2 硫酸-苯酚法檢測(cè)硫黃菌多糖</p><p>　　用硫酸-苯酚法檢測(cè)硫黃菌多糖，并與對(duì)照組比較，呈較明顯的陽(yáng)性顯色反應(yīng)，證明確實(shí)為多糖成分。其顏色的變化與含量呈正相關(guān)，一般顏色越深表明其濃度越大。 </p><p>　　3.3 采用DEAE纖維素交

50、換柱純化硫黃菌多糖</p><p>　　將過(guò)柱的液體每管取200uL加入到酶標(biāo)儀的上樣板中，調(diào)節(jié)紫外光的波長(zhǎng)，將其設(shè)置為490nm；測(cè)定其中多糖的含量。結(jié)果如圖1所示，在多糖的柱層析純化過(guò)程中，可以清楚地看到：不同濃度梯度的NaCl溶液洗脫后的溶液顏色對(duì)比相當(dāng)強(qiáng)，由此可以看出不同濃度洗脫后的硫黃菌多糖濃度不同。同時(shí)；圖4亦顯示硫黃菌多糖的含量主要集中在前9管中，后面幾乎沒(méi)有多糖洗脫下來(lái)，說(shuō)明多糖采用低離子濃度的洗

51、脫劑時(shí)即可分離洗脫下來(lái)，不宜采用高離子濃度的洗脫劑，需控制洗脫劑的離子濃度，以免離子濃度太大，達(dá)不到分離的目的。</p><p>　　圖1 多糖的含量變化曲線</p><p>　　3.4硫黃菌多糖的紅外譜測(cè)定</p><p>　　稱取5mg硫黃菌多糖后，研磨成粉末，在與先前準(zhǔn)備好的KBr粉末充分研磨混合，得到KBr的薄板。在傅里葉交換紅外色譜儀中4000cm-1至4

52、00cm-1的范圍內(nèi)掃描測(cè)定。如圖2所示，硫黃菌多糖在紅外譜中顯示3440.44cm-1和3213.30cm-1的寬吸收峰指定為O-H、N-H伸縮振動(dòng)峰；3213.30cm-1的吸收峰為不飽和的C-H的伸縮振動(dòng)區(qū)；1724.23 cm-1，1635.37 cm-1處的吸收峰為C=O的伸縮振動(dòng)峰；1401.14 cm-1的吸收峰為C-H的彎曲振動(dòng)峰；1310.84 cm-1,1189.84 cm-1,1109.81 cm-1的三處吸收峰表

53、明為吡喃糖環(huán)；這一系列的吸收峰都為多糖的特征吸收峰。</p><p>　　圖2.硫黃菌多糖的紅外譜測(cè)定</p><p><b>　　4 結(jié)論</b></p><p>　　本研究以硫黃菌子實(shí)體為材料，采用水浸提多糖，醇沉浸提濃縮液，乙醇除蛋白，DEAE-52離子交換純化多糖，再濃縮、透析的方法，獲得了硫黃菌多糖，并經(jīng)硫酸-苯酚法檢測(cè)，且與對(duì)照組比

54、較，呈較明顯的多糖陽(yáng)性顯色反應(yīng)，其顏色的變化與含量呈正相關(guān)。硫黃菌多糖在掃描電鏡下顯示為針狀結(jié)晶，晶體規(guī)整，透明度高。紅外譜顯示其在3416.00 cm-1、2928.00 cm-1等處有明顯多糖特征峰出現(xiàn)，且成分單一，無(wú)其他結(jié)構(gòu)特征峰，表明該多糖為一種純品多糖，該研究結(jié)果為其結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步確定和活性的研究奠定了基礎(chǔ)。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)：</b></p>&l

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64、與實(shí)施到論文的撰寫和修改，都凝聚著導(dǎo)師的心血。從他身上我學(xué)到了很多做人做事的道理，他淵博的知識(shí)、嚴(yán)謹(jǐn)?shù)闹螌W(xué)態(tài)度。敏銳的科學(xué)洞察力、踏實(shí)的工作作風(fēng)，以及大膽的創(chuàng)新精神都是我需要學(xué)習(xí)的地方。在此，謹(jǐn)向恩師表示我崇高的敬意和最真摯的感謝！</p><p>　　回顧大學(xué)時(shí)光，我過(guò)的很充實(shí)。在這里，還要感謝我的班主任以及各科任課老師，感謝你們對(duì)我的幫助，更感謝你們對(duì)我的諄諄教誨；你們不只是讓我學(xué)到了知識(shí)，更學(xué)會(huì)做人的道理。