增量表達抗病毒蛋白Bmlipase-1的家蠶轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)的建立.pdf

1、脂肪酶(Lipase)，國際生化聯(lián)合會的命名分類編號為EC．3.1.1.3，中文系統(tǒng)名稱為三脂酰甘油?；饷?。脂肪酶廣泛存在于動植物和微生物中，屬于α/β水解酶家族。脂肪酶在生物體中主要作用是水解三?；视?、二?；视?、單?；视汀⒏视鸵约坝坞x氨基酸的酯鍵等。家蠶脂肪酶1(BmLipase-1)是已被證實的對家蠶核型多角體病毒(BmNPV)具有強烈抵抗作用的內(nèi)源蛋白，而且其表達并不會因病毒攻擊而應激上調(diào)。本論文本研究旨在探討內(nèi)源增量表

2、達病毒抗性蛋白Bmlipase-1對病毒抗性的影響，以期為家蠶抗病育種提供新的思路。基于家蠶基因組精細圖和全基因組序列，系統(tǒng)鑒定了家蠶脂肪酶基因，并對相關(guān)基因的結(jié)構(gòu)及表達特征進行了分析。此外，通過基于piggyBac轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，構(gòu)建了肌動蛋白A4啟動子和病毒基因IE1啟動子啟動的BmLipase-1的表達載體，顯微注射獲得轉(zhuǎn)基因個體，并對轉(zhuǎn)基因株系進行了病毒抗性檢測。本文獲得的主要研究結(jié)果如下： 1．家蠶脂肪酶的生物信息

3、學分析。 基于序列的相似性及功能域保守性，在家蠶基因組數(shù)據(jù)庫中檢索可能的家蠶脂肪酶基因。成功地在家蠶中鑒定出了lipase基因家族的30個成員，染色體位置分析表明整個家族的成員比較分散，染色體定位分析顯示Bmlipase-1位于第5號染色體上。結(jié)合進化樹分析Bmlipase2基因可能與Bmlipase1互為重復基因。芯片數(shù)據(jù)顯示家蠶的lipase主要分為三種，一種在脂肪體和生殖腺中表達，一種在中腸和血液中表達，一種在絲腺中表達。

4、具有病毒抗性的Bmlipasel與果蠅lipase和人的lipase蛋白的同源性分別為56％和21％，組織芯片數(shù)據(jù)分析顯示其在5齡3天的中腸和血液中表達，以中腸的表達量最高，發(fā)育時期芯片數(shù)據(jù)顯示其在上簇以后不表達，同時BmNPV誘導芯片數(shù)據(jù)顯示其表達量并不受病毒的誘導而發(fā)生變化。 2．增量表達Bmlipase-1的轉(zhuǎn)基因表達載體的構(gòu)建。 以家蠶5齡3天中腸cDNA中為模板，克隆了Bmlipase-1全長CDS，通過pMD

5、19T—simpie、L4440、以及pSLfa1180fa和piggyBac[3xp3 EGFP afin]等多個基礎載體，成功構(gòu)建了增量表達Bmlipase-1的轉(zhuǎn)基因表達載體pBac[IEIP—lipase—sv40-3×P3—EGFPafm]和PBac[A4P—lipase—sv40-3xP3—EGFPafm]。轉(zhuǎn)基因載體通過酶切進行檢測，并經(jīng)測序確認正確。 3．轉(zhuǎn)基因陽性個體的獲得及分子檢測。 利用構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因

6、載體，選擇滯育性蠶品種大造作為受體材料，進行轉(zhuǎn)基因注射，篩選含有標記基因EGFP的陽性個體，并進行多代培養(yǎng)，成功獲得以IE1啟動子啟動Bmlipase-1表達的轉(zhuǎn)基因系IEI—Bmlipase-1和以A4為啟動子啟動Bmlipase1表達的轉(zhuǎn)基因系A4—Bmlipase-1。通過southem雜交、RT—PCR和定量PCR等技術(shù)對轉(zhuǎn)基因陽性株系的轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)和mRNA表達水平進行了檢測。結(jié)果顯示A4—Bmlipasel有3個拷貝，IE1

7、—Bmlipase1含有1個拷貝。而在轉(zhuǎn)錄水平，轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)Bmlipase-1的mRNA的表達量明顯高于非轉(zhuǎn)基因大造品種，而且A4—Bmlipasel轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)的Bmlipase-1的mRNA的表達量高于IEI—Bmlipase1轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)。 研究結(jié)果顯示，IEI—Bmlipase1轉(zhuǎn)基因系在3齡期前Bmlipase-1的mRNA表達量與非轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)的差距不大，在4齡起之后的表達量明顯提高。 4．轉(zhuǎn)基因陽性株系的病毒抗性

8、檢測。 為了驗證增量表達的BmNPV對蠶體病毒抗性的影響，我們對獲得的IEI—Bmlipase1轉(zhuǎn)基因系進行了攻毒檢測。經(jīng)ID50測試后設立2個病毒攻擊濃度2.66×104和3.46×104。 對攻毒結(jié)果進行統(tǒng)計學分析，表明Bmlipase-1在攻毒后的第8天，濃度為2.66×104的轉(zhuǎn)基因組1相較同濃度對照組1的抗病毒效果顯著，死亡率降低20％左右，而濃度為3A6×104轉(zhuǎn)基因組2的也有一定抗病效果，死亡率降低了15％

9、左右。攻毒后5至8天的曲線圖上顯示轉(zhuǎn)基因組與同濃度對照組相比，死亡時間延后。通過對攻毒后24小時以內(nèi)的材料進行定量PCR分析，轉(zhuǎn)基因組的lipase-1mRNA水平比對照組高，結(jié)合攻毒數(shù)據(jù)推測可能是lipase的增量表達產(chǎn)生了比較明顯的抗病效果，從而在總體水平上使得轉(zhuǎn)基因品系的死亡速度延緩。而因為繼發(fā)感染等各種原因，導致后期蠶只大量死亡以至于死亡率變得非常接近。 綜上所述，本論文基于家蠶全基因組精細圖譜和全基因組表達芯片數(shù)據(jù)，系

10、統(tǒng)鑒定和分析了家蠶的脂肪酶基因。成功構(gòu)建了增量表達病毒抗性蛋白Bmlipase-1的piggBac轉(zhuǎn)基因載體，經(jīng)顯微注射成功獲得iel啟動子啟動Bmlipase-1表達的iel+lipase-1轉(zhuǎn)基因系和A4為啟動子啟動Bmlipase-1表達的的A4+lipase-1轉(zhuǎn)基因系，基因表達量分析表明，轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)的病毒抗性蛋白Bmlipase-1的表達量明顯高于非轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)。對轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)進行病毒攻擊測試，結(jié)果顯示，較之于非轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)，轉(zhuǎn)基因