蘋果早期落葉病生物防治關(guān)鍵技術(shù)研究及其田間應(yīng)用.pdf

1、目前，蘋果早期落葉病已成為我國蘋果生產(chǎn)中最嚴重的病害之一，在我國各蘋果主產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，且發(fā)病率逐年上升，直接影響蘋果的產(chǎn)量和質(zhì)量，危害巨大。本研究對廣譜拮抗菌株分離篩選、菌株分類鑒定、拮抗菌株對病原菌的抑制作用、抑菌物質(zhì)的分離純化和研究、發(fā)酵工藝優(yōu)化和田間防治等蘋果早期落葉病生物防治關(guān)鍵技術(shù)進行了系統(tǒng)地研究，以期為蘋果早期落葉病的生物防治提供理論依據(jù)和奠定應(yīng)用基礎(chǔ)，旨在探索一條綠色高效、可持續(xù)的蘋果早期落葉病病害防治途徑。 采用

2、稀釋分離法從不同來源的11份樣品中分離純化得到細菌菌株173株，以8種植物病原菌為靶標(biāo)、采用平板對峙法、以抑菌效果明顯和菌株生長迅速為篩選標(biāo)準，進行植物病害廣譜拮抗菌株的篩選，共篩選得到廣譜拮抗菌株20株，其中有7株菌株對蘋果斑點落葉病病原菌(Alternaria alternata f．sp． Mali)和蘋果褐斑病病原菌(Marssonina coronaria(Ell Et Davis) Davis)均有明顯抑制作用。然后以Alt

3、ernaria alternata f．sp． Mali和Marssonina coronaria(EIl Et Davis) Davis為靶標(biāo)、采用平皿葉片法，對7株廣譜拮抗菌株進行蘋果早期落葉病廣譜拮抗菌株的復(fù)篩，復(fù)篩結(jié)果顯示菌株BS24和菌株D4的抑制效果最好，病葉抑制率分別為100％和90.48％。 結(jié)合傳統(tǒng)細菌分類鑒定方法和16S rDNA序列分析對拮抗菌株BS24和D4進行分類鑒定，結(jié)果表明菌株BS24應(yīng)為枯草芽孢桿

4、菌和菌株D4應(yīng)為巨大芽孢桿菌，Genbank登錄號分別為GQ213991和FJ755786。 研究了拮抗菌株BS24對病原菌的作用方式。菌株BS24可顯著抑制Alternaria alternata f．sp． Mali、Marssonina coronaria(Ell Et Davis) Davis的菌絲生長，抑菌帶寬度分別為9.5 mm和9.2 mm；可在蘋果葉片上迅速定殖、占據(jù)生存空間，使病原菌無法在葉片上定殖，從而有效地

5、阻斷了病原菌對蘋果葉片的侵染。菌株無細胞培養(yǎng)濾液同樣可明顯抑制病原菌的生長，對Alternaria alternata f．sp． Mali和Marssonina coronaria(Ell Et Davis) Davis的抑制率分別為85.48％和82.86％；可使病原菌菌絲生長畸形，出現(xiàn)扭曲變形、明顯交聯(lián)、部分部位斷裂、細胞質(zhì)聚集以及內(nèi)含物外溢等現(xiàn)象；還可導(dǎo)致芽管生長畸形，明顯抑制病原菌分生孢子的萌發(fā)。通過酸沉淀、甲醇抽提和RP—H

6、PLC等步驟，分離得到抑菌物質(zhì)BSP，經(jīng)研究初步確定其為一個小分子抑菌多肽。BSP抑菌譜較廣，對Alternaria alternata f．sp． Mali、Marssonina coronaria(Ell Et Davis) Davis、Phyllostictapirina、Bolyosphoma berengeriana、Fusarim oxysporium f． sp． Melonis、Glanerella cingulata、

7、Alternaria alternata fries Keissler和Alternaria solani等病原真菌和Escherichia coli均具有抑菌活性，其中對Alternaria alternata F．sp． Mali、Marssonina coronaria(Ell Et Davis)Davis的EC50分別為5.03μg/mL和5.60μg/mL。BSP具有良好的熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性和蛋白酶穩(wěn)定性。菌株BS24可分泌

8、胞外蛋白酶。 綜合考慮工業(yè)化生產(chǎn)要求，以發(fā)酵液活菌數(shù)為檢測標(biāo)準，從6種供試發(fā)酵培養(yǎng)基中選出初始發(fā)酵培養(yǎng)基。采用Plackett—Burman設(shè)計法、最陡爬坡試驗、中心組合設(shè)計法進行進一步的優(yōu)化，得到擬合良好的回歸方程，R2=0.96。模型驗證顯示預(yù)測值與實測值之間具有較好的擬合性，預(yù)測模型可靠。未優(yōu)化前發(fā)酵液活菌數(shù)為8.6×109 cfu/mL，優(yōu)化后為l5.08×109 cfu/mL，增加了75.35％。優(yōu)化后發(fā)酵工藝為淀粉1

9、.5 g，黃豆粉2.16 g，酵母膏0.3 g，蔗糖0.5 g，尿素0.2 g，MnSO40.01 g，MgSO40.01 g，K2HPO40.2 g，蒸餾水100 mL，pH7.0．轉(zhuǎn)速300 r/min，接種量7.8％。 田間試驗結(jié)果表明：拮抗菌劑三個不同濃度的處理均對蘋果早期落葉病有較好的防治效果，拮抗菌劑原液、拮抗菌劑50倍液和拮抗菌劑100倍液防治效果分別為83.14％、79.21％和76.99％，均顯著高于10％多抗