桉樹青枯病生物防治研究.pdf

1、本試驗通過對植物內(nèi)生細菌的BOX-PCR指紋圖譜分析及鑒定，利用植物內(nèi)生細菌及鏈霉菌防治桉樹青枯病，對植物內(nèi)生細菌、鏈霉菌及根際細菌在桉樹體內(nèi)的運轉規(guī)律的研究，為桉樹青枯病的生物防治打下了基礎，主要研究結果如下: 1.植物內(nèi)生細菌的BOX-PCR指紋圖譜分析及鑒定本研究利用植物內(nèi)生細菌CN017對BOX-PCR技術體系進行了優(yōu)化，并將篩選出的優(yōu)化因子應用于不同來源的內(nèi)生細菌CN008、CN015、CN017、CN030、CN06

2、1、CN062、CN063、CN064、CN078及根際細菌WCS358、WCS374、WCS417、7NSK2的BOX-PCR指紋圖譜分析，將其中6種細菌的分析結果與它們的16S rDNA序列的聚類分析進行了比較；通過Biolog生理生化鑒定和16S rDNA序列分析，對CN015、CN017、CN064、CN078四種細菌進行了初步的鑒定。試驗篩選出適于待測內(nèi)生細菌的25μL優(yōu)化體系中dNTP和引物以及Taq酶的用量為:dNTP0.

3、2 mmol/L，引物50pmol，2UTaq酶；對13種細菌的BOX-PCR指紋圖譜分析表明，PCR產(chǎn)物在200～2300bp位置有多條特定的電泳帶，可較好地揭示不同菌株間的差異；其中6種細菌的BOX-PCR聚群結果與16S rDNA序列分析有較好的一致性，說明BOX-PCR技術是一種快速而有效的DNA指紋技術，尤其適用于分析大量的菌株或分離株。經(jīng)Biolog生理生化鑒定和16S rDNA序列分析將4種內(nèi)生細菌初步確定為:CN015為

4、Pseudomonas putida、CN017為P.poae、CN064為P.synxartha、CN078為P.fluorescens。 2.植物內(nèi)生細菌防治桉樹青枯病本試驗測定了植物內(nèi)生細菌CN030、CN064、CN078對青枯病菌的平板拮抗活性，并利用CN015r、CN017r、CN030、CN064、CN078在離體條件下、無菌條件下及土壤系統(tǒng)中進行桉樹青枯病的防治研究；為提高其防效，在土壤系統(tǒng)中進行了內(nèi)生細菌有效載

5、體的篩選。在KB平板培養(yǎng)基上CN078和CN064對青枯菌都有明顯的拮抗活性，其中CN078效果最好，抑菌圈達到33.5mm。離體條件下，采用內(nèi)生細菌與青枯菌菌懸液進行比例混合，CN015r、CN017r、CN064、CN078對桉樹青枯病有明顯的防治效果，而CN030發(fā)病率達到了88.8％沒有防治效果；在無菌條件下，青枯病菌對尾葉桉無菌實生苗具有很強的致病性，經(jīng)篩選確定河沙中青枯菌量為2.5×100CFU·g-1，與對照相比CN017

6、r、CN064、CN078對于桉樹青枯病具有較強防治效果，CN030對桉苗的正常生長有一定的影響。在土壤系統(tǒng)中接種青枯病菌15 d后，CN015r、CN017r、CN064防治效果達到差異水平，CN030、CN078與對照相比沒有差異。測定的四種載體在土壤系統(tǒng)中，對于對于內(nèi)生細菌對于桉樹青枯病的防治效果沒有明顯的提高，且四種載體對于桉苗的生長均有一定的影響。 3.利用鏈霉菌防治桉樹青枯病本試驗從桉樹中進行了內(nèi)生鏈霉菌的分離，并對

7、分離到的菌株與內(nèi)生鏈霉菌CN120、CN121(從棗樹果實中分離)及金色鏈霉菌、武夷菌素鏈霉菌、龜裂鏈霉菌、玫瑰黃鏈霉菌對于青枯病菌的平板拮抗活性進行了測定，將對桉樹青枯病菌具有拮抗活性的菌株在不同的系統(tǒng)中進行了防效測定。試驗從尾巨桉中分離到一株鏈霉菌CN122(初步鑒定為鏈霉菌)，在平板KB培養(yǎng)基上龜裂鏈霉菌、武夷菌素鏈霉菌和CN122對青枯菌都有明顯的拮抗活性，其它菌株沒有效果。在離體條件下，龜裂鏈霉菌、CN122處理桉苗在第10d

8、的發(fā)病率與對照相比達到顯著水平，而武夷菌素鏈霉菌發(fā)病率較對照有所增高；無菌條件下，CN122的發(fā)病率與對照相比下降了40％，龜裂鏈霉菌第20d時發(fā)病率與對照相比也存在一定差異。土壤系統(tǒng)中，對第10d的發(fā)病率進行統(tǒng)計分析表明，在α=0.05時CN122防治效果達到差異水平，龜裂鏈霉菌與對照相比沒有差異:至15d，龜裂鏈霉菌、CN122發(fā)病率與對照相比達到顯著水平。 4.植物內(nèi)生菌、鏈霉菌及根際細菌在桉樹體內(nèi)的定殖和運轉規(guī)律本試驗在

9、無菌條件下，對植物內(nèi)生菌、鏈霉菌、根際細菌在桉樹體內(nèi)的運轉規(guī)律進行了研究。結果表明，無菌條件下萌發(fā)的桉苗內(nèi)未檢測到可培養(yǎng)的內(nèi)生細菌；通過浸種處理、桉苗與細菌共培養(yǎng)、葉片接種和菌液蘸根的方法，內(nèi)生細菌CN017r均可以進入桉樹無菌實生苗體內(nèi)，其中以桉苗與細菌共培養(yǎng)的方法，根部內(nèi)生細菌定殖的數(shù)量最多(7.651g CFU.g-1)，其次是浸種處理和菌液蘸根；通過葉片接種后CN017r能夠在接種葉片內(nèi)很好的定殖，并且向下部葉片運轉。CN017

10、r在不同的桉樹中均可以定殖，所測三種桉樹同一時間根部和莖中段內(nèi)生細菌CN017r定殖的數(shù)量，以鄧恩桉最多，其次是尾葉桉和赤桉，第30d時檢測只在尾葉桉的頂芽檢測到少量內(nèi)生菌(4.751g CFU.g-1)；內(nèi)生細菌CN015r、CN017r、CN064、CN078對于尾葉桉并無?；裕寄軌蛟阼衩绺慷ㄖ?，除CN017r外的三種內(nèi)生細菌在30d內(nèi)都沒有到達植株頂芽。鏈霉菌CN122能夠在尾葉桉體內(nèi)定殖，但是定殖數(shù)量較內(nèi)生細菌少，龜裂鏈霉