遲緩愛德華菌菌蛻疫苗的構(gòu)建及動物免疫試驗.pdf

1、遲緩愛德華菌（Edwardsiella tarda）是危害水產(chǎn)養(yǎng)殖的病原菌之一，可引起多種類型的感染，致病機理復(fù)雜。由遲緩愛德華菌引起的疾病在世界海水、淡水養(yǎng)殖動物中普遍流行。
　　 化學(xué)藥物是治療遲緩愛德華菌感染的一種重要手段，但又會引起食品藥物殘留、細菌耐藥性等問題。盡管預(yù)防遲緩愛德華菌感染的疫苗報道很多，但這些常用疫苗多是福爾馬林（或熱）滅活疫苗或亞單位疫苗，影響了細菌表面抗原的物理化學(xué)結(jié)構(gòu)，影響了疫苗的免疫效果，而一些亞

2、單位疫苗又缺少足夠的免疫原性，常需加入免疫佐劑使用，而這些免疫佐劑有可能具有副作用。
　　 細菌菌蛻是通過調(diào)控噬菌體PhiX174的裂解基因E在革蘭氏陰性細菌中表達而形成的無細胞漿和繁殖能力的細菌空殼，因其保持了細菌原有的細胞形態(tài)、細菌表面抗原性和黏附性等特性，即使象菌毛一樣脆弱的結(jié)構(gòu)也能被保護。同時，菌蛻包含LPS、類脂、肽聚糖等天然的免疫刺激復(fù)合物，無須使用佐劑。因此，菌蛻疫苗能誘導(dǎo)更強的免疫反應(yīng)，是一種比常規(guī)疫苗更理想的新

3、型疫苗體系。
　　 本研究首次在國內(nèi)報道遲緩愛德華菌菌蛻疫苗的制備及應(yīng)用。
　　 1遲緩愛德華菌制苗菌株的篩選
　　 通過形態(tài)學(xué)觀察、選擇性培養(yǎng)基篩選、生理生化分析、PCR鑒定及16S rDNA序列測定，證明本實驗室保存的細菌為遲緩愛德華菌。應(yīng)用PCR方法檢測了遲緩愛德華菌的6個毒力基因在國內(nèi)外分離株中的分布情況，并根據(jù)其溶血活性、對斑馬魚和小鼠的致病性研究，篩選出強毒株，為進一步后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。
　　

4、 本研究成功構(gòu)建溶菌質(zhì)粒載體，并將其轉(zhuǎn)入遲緩愛德華菌真鯛分離株，通過溫度誘導(dǎo)并跟蹤檢測其溶菌動力學(xué)過程，制備出遲緩愛德華菌菌蛻疫苗。掃描電鏡和透射電鏡觀察，證實細菌結(jié)構(gòu)未改變，且不含內(nèi)容物。
　　 3以小鼠動物模型評價遲緩愛德華菌菌蛻疫苗的口服免疫效果
　　 分別用菌蛻疫苗(ETG)、福爾馬林全菌滅活疫苗(FKC)和PBS口服免疫小鼠，并跟蹤檢測其體液免疫水平和細胞免疫水平的變化。結(jié)果表明，ETG免疫組血清IgA和Ig

5、G的抗體滴度與FKC和PBS免疫組相比，差異顯著；ETG免疫組小鼠外周血淋巴細胞中CD3+/CD4+/CD8+陽性的百分率與FKC和PBS免疫組相比，差異顯著。同源菌攻擊試驗表明，ETG、FKC和PBS組的相對保護率分別為86.7％(26/30)，73.3％(22/30)和33.3％(10/30)。結(jié)果表明，ETG疫苗能誘導(dǎo)強烈的細胞免疫和體液免疫，提高免疫保護能力。
　　 4遲緩愛德華菌菌蛻疫苗對斑馬魚的免疫保護試驗
　

6、　 詳細闡述研究斑馬魚白細胞吞噬活性的方法，并研究了遲緩愛德華菌蛻疫苗對斑馬魚白細胞吞噬活性的影響。試驗表明，ETG免疫組的白細胞吞噬活性明顯高于FKC和PBS免疫組，差異顯著。攻擊試驗結(jié)果顯示，ETG的免疫保護率高達83.3％(25/30)，與FKC和PBS免疫組的70％(21/30)和6.7％(2/30)相比，差異顯著。結(jié)果表明，ETG疫苗能有效地激活魚類的免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生免疫保護。
　　 5應(yīng)用裂解基因和核酸酶基因共表達制

7、備菌蛻疫苗
　　 葡萄球菌核酸酶A(SNA)對單鏈、雙鏈DNA或RNA均具有較強的降解能力。成功構(gòu)建表達葡萄球菌核酸酶A不同片段的質(zhì)粒載體，通過誘導(dǎo)表達發(fā)現(xiàn)酶活性只與N’末端氨基酸序列有關(guān)，并發(fā)現(xiàn)編碼SNA N’末端26個氨基酸的序列與λ噬菌體Cro基因融合表達可以降解細菌核酸，又可以被λ噬菌體的cI857ts/PR調(diào)節(jié)系統(tǒng)調(diào)控。因此，利用這一技術(shù)成功構(gòu)建調(diào)控噬菌體裂解基因和葡萄球菌核酸酶基因先后表達的質(zhì)粒載體，制備出安全性更高