Eha調(diào)控遲緩愛德華氏菌適應(yīng)胞內(nèi)生存環(huán)境的機制探索.pdf

1、遲緩愛德華菌（Edwardsiella tarda，Et）屬于腸桿菌科愛德華菌屬，是一種胞內(nèi)寄生菌。遲緩愛德華菌溶血相關(guān)基因(Ethaemolysin activator gene，簡稱eha)是一個重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因，能夠調(diào)控Et抵抗巨噬細胞內(nèi)氧化和酸化等殺菌壓力，有助于Et在巨噬細胞內(nèi)的生存。然而，這機制尚未完全闡明。
　　為了檢測不同應(yīng)激環(huán)境下的eha基因轉(zhuǎn)錄水平。首先以Et菌ET-13基因組為模板，擴增eha基因的啟動子區(qū)

2、域，構(gòu)建eha基因的啟動子探針pMP220-PehaLacZ載體，并將其電擊導(dǎo)入eha缺失株，獲得pMP220-PehaLacZ-△eha株。然后模擬細菌在巨噬細胞內(nèi)的生存環(huán)境，檢測了在不同的氧化及酸性條件下含該載體細菌的β-gal活性，發(fā)現(xiàn)對數(shù)期細菌在條件pH6.3和0.10％H2O2LB處理2h轉(zhuǎn)錄水平較高，而前者轉(zhuǎn)錄水平最高。為了進一步檢測eha基因是否存在對自身的調(diào)控，比較在pH6.3和0.10％H2O2處理2h對數(shù)期pMP22

3、0-PehaLacZ-ET13菌和pMP220-PehaLacZ-△eha菌的β-gal活性，發(fā)現(xiàn)含該載體的野生菌β-gal的活性均明顯低于該載體的缺失菌(p＜0.05)，說明eha基因?qū)τ谧陨肀磉_起負調(diào)控作用。
　　選擇一個Eha轉(zhuǎn)錄水平最高的條件(pH6.3)，培養(yǎng)ET-13野生株與eha缺失株，分別提取兩細菌的RNA，其純度高，滿足建庫要求，送華大公司進行Illumina HiSeqTM2000轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-Seque

4、ncing），該序列信息已提交至NCBI Sequence Read Achieve數(shù)據(jù)庫（登錄號:SRX1898774），并進行測序質(zhì)量評估。為了構(gòu)建Et菌的兩個cDNA文庫，其mRNA被隨機性打斷，其隨機性評估表明，這兩細菌測序不同的長度的clean reads在Et菌ATCC15947參考基因組中分布均勻。利用比對軟件SOAPaligner/SOAP2軟件，將clean reads與Et菌ATCC15947參考基因組序列進行比對，

5、這兩細菌的clean reads中覆蓋率在90％以上的基因分別超過92％。采用RNA-Sequencing測序比較了這兩細菌在酸性條件下的轉(zhuǎn)錄本，篩選出147個差異表達基因（|log2Ratio|≥1），其中113個基因表達水平上調(diào)，34個基因表達水平下調(diào)。此外，選取15個差異表達基因進行qRT-PCR隨機抽樣，兩者趨勢呈強相關(guān)，驗證RNA-Sequencing數(shù)據(jù)的準確性。通過對147個基因采用CO數(shù)據(jù)庫進行功能聚類，分成25類，主要

6、涉及細菌加工、定位、代謝、結(jié)合、催化、運輸、細胞成份;通過對147個差異表達基因進行KEGG Pathway富集分析，有130個基因可以富集到55條路徑(Pathway)中，包括與氨基酸、核苷酸、脂質(zhì)代謝及鐵的轉(zhuǎn)運等路徑，涉及基因較多的有雙組分系統(tǒng)、ABC轉(zhuǎn)運系統(tǒng)、不同環(huán)境中的微生物代謝和次級代謝產(chǎn)物等路徑。
　　為了進一步尋找Eha直接調(diào)控靶點，利用商品化的Flag單抗富集Eha-Flag蛋白，首先eha基因的3末端引入了PCR

7、的Flag標簽.構(gòu)建Eha蛋白融合表達載體pGEX-4T-ehaflag，然后將該載體電擊入eha缺失株中，細菌感染細胞實驗的結(jié)果表明，Eha-Flag融合蛋白可以恢復(fù)eha缺失株在胞內(nèi)降低生存的能力。進一步摸索染色質(zhì)免疫共沉淀超聲的條件，利用商品化的Flag單抗免疫沉淀Eha-DNA片段，除去結(jié)合的蛋白并純化DNA片段。并根據(jù)RNA-sequencing得到的差異表達基因設(shè)計引物，通過熒光定量PCR鑒定ChIP富集到Eha的結(jié)合靶點，