新城疫病毒氣溶膠發(fā)生與傳染機(jī)制及其在生產(chǎn)雞舍環(huán)境中的監(jiān)測.pdf

1、畜禽傳染病如新城疫(Newcastle disease，ND)、禽流感(Avian Influenza，AI)、口蹄疫(Foot-and-Mouth disease，F(xiàn)MD)等疾病的病原都可以通過空氣傳播，造成傳染病的流行。2002-2003年SARS和近幾年來高致病性禽流感(Highly pathogenic avian influenza，HPAI)的暴發(fā)流行，警示人們應(yīng)重視病毒氣溶膠及其氣源性傳染規(guī)律的研究。ND是危害最嚴(yán)重的家禽

2、傳染病之一，世界動物衛(wèi)生組織(World Organisation for Animal Health，OIE)將其定為法定報告類疫病。然而，ND傳播途徑研究沒能得到應(yīng)有的重視。Gloster(1983)通過對兩起ND爆發(fā)的分析，認(rèn)為ND流行主要是由氣載新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)引起的：氣源傳播在新城疫流行中起著重要作用。這種傳播方式在1970-1971年的英格蘭ND爆發(fā)和1973年北愛爾蘭ND

3、流行中起了重要作用，并已經(jīng)有證據(jù)證明NDV可發(fā)生遠(yuǎn)距離的傳播。以上學(xué)者的觀點盡管確認(rèn)了ND的氣源性傳染途徑，然而，NDV氣溶膠的發(fā)生和傳染機(jī)制不詳，需要實驗證明。因此，開展本研究。本課題建立了NDV氣溶膠發(fā)生及傳播感染的實驗?zāi)Ｐ?，動態(tài)檢測了人工感染雞NDV氣溶膠排出的時間，濃度：驗證NDV F48E9株可以通過氣源傳播感染健康雞群。并進(jìn)一步研究了感染NDV的雞群排出的NDV氣溶膠向周圍環(huán)境擴(kuò)散并感染10m、20m外的雞群；對NDV氣溶膠

4、不同感染途徑的感染劑量進(jìn)行對比研究；在此基礎(chǔ)上，收集生產(chǎn)雞舍中的空氣，對其中的NDV進(jìn)行分子檢測及分離鑒定，對氣載NDV分離株的部分分子特性進(jìn)行了研究；應(yīng)用ERIC-PCR動態(tài)監(jiān)測了感染NDV氣溶膠SPF雞腸道菌群的變化。本研究不僅對深入認(rèn)識ND的傳染機(jī)制非常必要，而且對揭示像SARs、禽流感等氣源性傳染病的傳播機(jī)制帶來有益的啟示。 1、新城疫病毒氣溶膠發(fā)生及其傳染的實驗研究 本實驗建立一個NDV氣溶膠發(fā)生、傳播及感染的

5、實驗?zāi)Ｐ?，進(jìn)行實驗1(T1)和實驗2(T2)。隔離器A中的SPF雞(G1)點眼、滴鼻接種NDV后用AGI-30收集A中的氣體，檢測氣體樣品中的NDV，用蝕斑計數(shù)法測定NDV氣溶膠濃度；隔離器B中的SPF雞(G2)接受氣源性被動感染。定期收集實驗雞的口咽和泄殖腔拭子，檢測拭子中的NDV，確定排毒情況；每7天收集實驗雞血液樣品，應(yīng)用HI-T檢測抗體。試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)：T1和T2分別在攻毒后第二天和第三天檢測到NDV氣溶膠，其濃度分別在第13天和

6、第11天達(dá)到高峰，為1.69×104 PFU/m3空氣和9.14×103 PFU/m3空氣，到第40天NDV氣溶膠濃度仍分別為6.98×103 PFU/m3空氣和3.78×103 PFU/m3空氣；T1G1和T2G1組雞均在攻毒后第二天檢測到排毒；T1G2組和T2G2組接受氣源被動感染7天后檢測分別有80％和60％的雞排毒，抗體分別在感染后第7天和第14天呈陽性，為4.07和7.40，一直到第四十天均為陽性。 結(jié)果表明SPF雞在

7、感染NDV后三天內(nèi)排出NDV，并能夠很快形成氣溶膠；NDV氣溶膠能夠感染健康雞只。 2、新城疫病毒氣溶膠向周圍環(huán)境擴(kuò)散感染的實驗研究 共進(jìn)行兩組實驗，一組是新城疫病毒氣溶膠向周圍環(huán)境擴(kuò)散的實驗研究；一組是10m，20m氣源傳播感染實驗。擴(kuò)散試驗時設(shè)一組SPF雞經(jīng)點眼、滴鼻接種NDV后用AGI-30收集接種雞處(S0)距離接種感染雞10m(S10)、20m(S20)處中的氣體，檢測并定量氣體樣品中的NDV，揭示動物舍NDV

8、氣溶膠向周圍環(huán)境的傳播情形。結(jié)果表明，S0處氣體樣品中從接種后第3天開始檢測到NDV，濃度在11天達(dá)到高峰，一直到第30天RT-PCR檢測結(jié)果仍為陽性；S10處及S20處氣體樣品中均從接種后第5天開始檢測到NDV，濃度在11-13天達(dá)到最大值，一直到第25天RT-PCR檢測結(jié)果仍為陽性。感染試驗時設(shè)三組試驗雞，分別為人工接種雞(G0)，點眼、滴鼻接種NDV，在距離接種雞10m(G10)、20m(G20)處SPF雞接受氣源感染的哨兵組雞，

9、通過檢測哨兵組雞的排毒及抗體來確定是否發(fā)生氣源感染，具體檢測方法同試驗一。氣源擴(kuò)散感染試驗結(jié)果表明G10及G20持續(xù)氣源被動感染7后開始檢測，均檢測到排毒直到第28天仍然排毒。 結(jié)果表明SPF雞在感染NDV后三天內(nèi)排出NDV，并能夠很快形成氣溶膠，傳播擴(kuò)散到20m；NDV氣溶膠能夠感染10m、20m處健康雞只。 3、SPF雞經(jīng)不同途經(jīng)的感染劑量及致死劑量實驗研究 本實驗分別通過呼吸道(通過人工發(fā)生定量NDV氣溶膠

10、感染SPF雞)、消化道(喂服)及肌肉注射途徑定量感染NDV，通過檢測雞的特異性抗體判定雞是否發(fā)生感染，ID50、LD50計算方法采用的加權(quán)直線回歸法(Bliss法)。結(jié)果表明NDV氣溶膠半數(shù)感染吸入劑量為30.53 PFU，95％置信區(qū)間為9.46098.54(PFU)；半數(shù)致死劑量為117.05 PFU，95％置信區(qū)間為23.71-577.92 PFU。NDV通過消化道半數(shù)感染灌服劑量為4419.78 PFU，95％置信區(qū)間為1095

11、.34-17834.14(PFU)；半數(shù)致死劑量為44743.91PFL，95％置信區(qū)間為10161.62-197017.62(PFU)。NDV經(jīng)肌肉注射途徑半數(shù)感染注射劑量為16.63 PFU，95％置信區(qū)間為4.85-57.00(PFU)；半數(shù)致死劑量為69.60 PFU，95％置信區(qū)間為14.24-340.27(PFU)。 結(jié)果表明不同感染途徑的致病性有差異，肌肉注射致病性最強(qiáng)，氣溶膠次之，消化道最弱。 4、雞舍中

12、氣載雞新城疫病毒的檢測及分離鑒定 本研究采用AGI-30氣體收集器在五個大型雞舍舍內(nèi)收集氣體(15份/舍)，同時采集雞的氣管和泄殖腔拭子，采用兼并引物RT-PCR檢測氣體樣品和拭子中的新城疫病毒(NDV)，并鑒別NDV的毒力；同時分離、純化氣體樣品中的NDV，用常規(guī)毒力學(xué)實驗鑒別分離株的毒力。結(jié)果五個雞舍中，在雞舍A中，2份氣體樣品和4份口咽及泄殖腔拭子中檢測到弱毒，均沒檢測到強(qiáng)毒。在雞舍B中，7份氣體樣品和5份口咽及泄殖腔拭子

13、中檢測到弱毒，而僅在5份氣體樣品中檢測到強(qiáng)毒；在雞舍C中，6份氣體樣品和5份口咽及泄殖腔拭子中檢測到弱毒，而僅在2份氣體樣品中檢測到強(qiáng)毒；在雞舍E中，7份氣體樣品和1份口咽及泄殖腔拭子中檢測到弱毒，而在所有樣品中均未檢測到強(qiáng)毒。分離純化后總共得到7株NDV，其中3株為強(qiáng)毒，4株為弱毒。在雞舍A中得到一株弱毒YTCX08，在雞舍B中得到一株強(qiáng)毒DZ07和一株弱毒DZ0702，在雞舍C中得到2株強(qiáng)毒MH07和MH0702和1株弱毒MH070

14、3，在雞舍E中得到一株弱毒NY06。 結(jié)果表明兼并引物RT-PCR可快速、直接對氣體樣品進(jìn)行檢測及鑒別診斷，有助于ND的防治。 5、氣載新城疫病毒野毒株F基因重要片段的克隆及遺傳變異分析 根據(jù)已發(fā)表文獻(xiàn)針對新城疫病毒(NDV)F基因序列設(shè)計了1對引物，對從氣體中分離的7株NDV毒株的F基因重要功能區(qū)片段擴(kuò)增進(jìn)行了擴(kuò)增和序列測定，并與多株已報道的NDV參考株相應(yīng)片段進(jìn)行序列比較，經(jīng)遺傳基因進(jìn)行化樹分析。結(jié)果表明，七

15、株氣載新城疫病毒分離株之間的同源性為79.3％-100％；氨基酸的同源性為77.4％-100％，分離到的四株野毒NY06、MH0703、YTCX08與DZ0702均屬于基因II型，在裂解位點的氨基酸序列(111GGRQGRL117)與NDV弱毒株特征相符合；MH07屬于基因Ⅸ型；DZ07、MH0702均屬于基因VII型，這三株在裂解位點的氨基酸序列(111GRRQKRF17)與NDV強(qiáng)毒株特征相符合。 6、新城疫病毒氣溶膠感染S

16、PF雞腸道菌群結(jié)構(gòu)變化的研究 SPF雞定量感染NDV氣溶膠后，定期采集試驗雞的糞便，檢測其中大腸桿菌的濃度變化，同時應(yīng)用ERIC-PCR對腸道菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行了動態(tài)檢測；同時對健康雞進(jìn)行同樣研究作對比。結(jié)果表明，通過與對照組腸道大腸桿菌的檢測比較，結(jié)果大腸桿菌在感染初期高于對照組(P<0.01)，而嚴(yán)重感染開始出現(xiàn)死亡時開始降低，明顯低于對照組(P<0.01)，恢復(fù)期大腸桿菌總數(shù)開始回升，與對照組差異不顯著(P>0.05)。ERI