匍匐型地被菊轉(zhuǎn)DmDREBa基因研究.pdf

1、匍匐型地被菊作為一類(lèi)同時(shí)具備綠化、美化、彩化和香化綜合功能的新奇缺地被植物，在公園與城市綠化上應(yīng)用前景極為廣闊。本研究以本課題組近年選育的匍匐型地被菊品種‘雨花勛章’為試材，建立了其高效再生體系；采用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對(duì)地被菊無(wú)菌葉盤(pán)進(jìn)行了菊花來(lái)源的DmDREBa基因同源遺傳轉(zhuǎn)化研究，優(yōu)化了其遺傳轉(zhuǎn)化體系；對(duì)轉(zhuǎn)基因后代逆境脅迫耐性（低溫、干旱、高鹽）進(jìn)行了初步鑒定，同時(shí)探討了與脅迫耐性提高有關(guān)的生理生化基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下：
　　

2、 1.匍匐型地被菊高效再生體系的建立
　　 以匍匐型地被菊品種‘雨花勛章’、‘雨花金桂’和‘雨花銀桂’為試材，比較了不同基因型品種葉片離體再生能力，研究了不同激素濃度配比、葉片發(fā)育程度、暗培養(yǎng)對(duì)‘雨花勛章’葉片再生的影響.結(jié)果表明，‘雨花勛章’的再生能力明顯高于其他兩個(gè)品種，其最佳誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基為MS+6-BA1.0 mg·l-1+NAA1.0 mg·l-1，再生率達(dá)91.1％，平均芽數(shù)為7.27，再生芽在1/2 MS+NAA

3、0.1 mg·l-1培養(yǎng)基上生根率達(dá)100％，可以滿(mǎn)足遺傳轉(zhuǎn)化的需要。研究還發(fā)現(xiàn)，25d苗齡的無(wú)菌苗頂端幼葉為最佳取材時(shí)期和部位。分化前期一定時(shí)間的暗培養(yǎng)可防止愈傷組織褐變，提高再生率.
　　 2.根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立
　　 以‘雨花勛章’試管苗為試材，對(duì)預(yù)培養(yǎng)、農(nóng)桿菌侵染時(shí)間、共培養(yǎng)時(shí)間、延遲培養(yǎng)時(shí)間、誘導(dǎo)物、篩選方式、抑菌方法等與遺傳轉(zhuǎn)化相關(guān)的參數(shù)進(jìn)行了研究，建立的最優(yōu)轉(zhuǎn)化體系為：以25d苗齡的無(wú)菌苗頂

4、端幼葉作為轉(zhuǎn)化受體，預(yù)培養(yǎng)3d，菌液OD600為0.5時(shí)侵染10min，25℃黑暗條件共培養(yǎng)3d，延遲培養(yǎng)3d。利用此體系進(jìn)行了穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化。另外，在共培養(yǎng)基中添加誘導(dǎo)物乙酰丁香酮（AS）會(huì)導(dǎo)致外植體褐化加速，不利于轉(zhuǎn)化?！昊▌渍隆瘜?duì)潮霉素十分敏感，10 mg·l-1潮霉素能夠完全抑制葉片再生并使其褐死，8 mg·l-1已完全抑制了不定芽生根，在實(shí)際研究中，一般確定篩選濃度略低于臨界致死濃度，因此，葉盤(pán)再生篩選濃度以6～8 mg·l

5、-1為宜，生根篩選濃度以7mg·l-1為宜，在葉盤(pán)篩選過(guò)程中選用逐步降低選擇壓，長(zhǎng)時(shí)間多次篩選的方法，以克服潮霉素對(duì)不定芽生長(zhǎng)的抑制作用。抑菌抗生素（羧芐青霉素）對(duì)‘雨花勛章，葉片再生具有強(qiáng)烈抑制作用，350 mg·l-1羧芐青霉素在有效抑制根癌農(nóng)桿菌生長(zhǎng)的同時(shí)也抑制了不定芽的再生，降低到250 mg·l-1時(shí)可獲得60％的再生率，但抑菌效果不顯著，采用逐步降低抑菌素濃度的方法，即在延遲培養(yǎng)階段使用350mg·l-1徹底脫菌，之后降為2

6、50 mg·l-1、150 mg·l-1抑制農(nóng)桿菌滋生取得了較好效果，有效地提高了轉(zhuǎn)化效率。
　　 3.地被菊抗性芽的篩選、植株再生和檢測(cè)
　　 抗性愈傷和抗性芽篩選過(guò)程中，首先選用延遲篩選的方法將受侵染葉盤(pán)在Ms+6-BA1.0 mg·l-1+NAA1.0 mg·l-1+carb350 mg·l-1培養(yǎng)基上延遲培養(yǎng)3d，再轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基Ms+6-BA1.0 mg·l-11+NAA1.0 mg·l-1+Hyg8 mg·l

7、-1+carb250 mg·l-1黑暗培養(yǎng)至誘導(dǎo)出抗性愈傷，然后將整個(gè)葉盤(pán)轉(zhuǎn)入MS+6-BA1.0 mg·l-1+NAA1.0 mg·l-1+Hyg6 mg·l-1+carb150 mg·l-1培養(yǎng)基繼續(xù)篩選至萌發(fā)抗性芽點(diǎn)，切取帶有抗性芽點(diǎn)的愈傷塊轉(zhuǎn)入零選擇壓的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基Ms+6-BA1.0 mg·l-1+NAA1.0 mg·l-1使抗性芽恢復(fù)生長(zhǎng)，待不定芽長(zhǎng)到2cm左右時(shí)，切取不定芽轉(zhuǎn)入生根篩選培養(yǎng)基1/2Ms+NAA0.1mg·

8、l-1+Hyg7mg·l-1進(jìn)行生根篩選。將生根篩選獲得的部分抗性單株（48株）進(jìn)行潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（HPT）的PCR鑒定，初步獲得了28株轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株，隨機(jī)抽取8株進(jìn)行Southern雜交檢測(cè)。結(jié)果表明，6株P(guān)CR陽(yáng)性植株的目的基因已經(jīng)整合到地被菊基因組DNA中，并且以2～4個(gè)拷貝的形式隨機(jī)插入。轉(zhuǎn)基因試管苗經(jīng)過(guò)煉苗、移栽，2個(gè)月后全部成活。
　　 4.轉(zhuǎn)基因植株對(duì)低溫、干旱、鹽漬逆境脅迫的耐性檢測(cè)
　　 對(duì)6個(gè)

9、 Southern雜交鑒定的T0代陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因株系和未轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行低溫脅迫處理，結(jié)果顯示，6個(gè)35S：DmDREBa株系腳芽半致死溫度分別為-18.92℃、-19.49℃、-20.22℃、-20.36℃、-20.36℃和-20.57℃，均低于對(duì)照-17.43℃.選取差異顯著的35S：TDa4和35S：TDa5兩個(gè)株系進(jìn)一步進(jìn)行低溫、干旱和高鹽耐性分析，結(jié)果表明，低溫處理后，兩個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的耐低溫能力均有不同程度提高，從生理變化上看，過(guò)氧

10、化物酶POD活性和脯氨酸（Pro）含量均高于對(duì)照，丙二醛（MDA）含量均低于對(duì)照，且株系35S：TDa4變化更明顯；干旱脅迫下，35S：TDa4和35S：TDa5植株的鮮樣質(zhì)量保持率顯著高于對(duì)照，存活率分別為43.8％和31.3％，顯著高于對(duì)照（6.3％），超氧化物歧化酶SOD活性扣脯氨酸（Pro）含量均有所提高，丙二醛（MDA）的含量則均低于對(duì)照，表明轉(zhuǎn)基因株系的耐旱能力得到提高；高鹽脅迫后，35S：TDa4和35S：TDa5植林存活