烯唑醇和烯效唑酶聯(lián)免疫分析方法研究.pdf

1、酶聯(lián)免疫分析技術(shù)具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便、適宜現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控和大量樣品的篩選等優(yōu)點(diǎn)，在農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)中發(fā)揮著重要的作用。本論文以烯唑醇和烯效唑?yàn)檠芯繉?duì)象，對(duì)其酶聯(lián)免疫分析方法進(jìn)行了深入系統(tǒng)的研究，主要研究結(jié)果如下：
　　 對(duì)烯唑醇和烯效唑的結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，分別和琥珀酸酐反應(yīng)合成了烯唑醇半抗原和烯效唑半抗原，采用碳二亞胺法將半抗原和牛血清蛋白(BSA)偶聯(lián)制備了免疫抗原，采用混合酸酐法將半抗原與卵清蛋白(OVA)偶聯(lián)制備了包被抗

2、原。經(jīng)紫外光譜分析證明成功合成了免疫和包被用人工抗原，烯唑醇免疫原和包被原的結(jié)合比分別為27:1和9:1，烯效唑免疫原和包被原的結(jié)合比分別為17:1和5:1。用免疫抗原免疫雄性新西蘭大白兔，分別獲得了針對(duì)烯唑醇和烯效唑的特異性抗血清，用辛酸-硫酸銨法分離純化抗血清，冷凍干燥后獲得抗烯唑醇抗體和抗烯效唑抗體，用間接非競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)測(cè)定烯唑醇和烯效唑抗體的效價(jià)分別達(dá)到2.56×105和1.02×106。
　　

3、通過(guò)研究甲醇含量、離子強(qiáng)度、pH值對(duì)抗原抗體反應(yīng)靈敏度的影響，優(yōu)化了烯唑醇間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ic-ELISA)的分析條件，確定了20％甲醇、0.4mol/LNa+強(qiáng)度、pH7.5為烯唑醇ic-ELISA的最佳工作條件。利用優(yōu)化后的分析條件，用ic-ELISA法進(jìn)行了方法的精密度、抗體親和性和特異性研究，結(jié)果表明得到的抗體對(duì)烯唑醇有較高的親和性和特異性，方法的精密度也符合農(nóng)殘分析的要求。該方法的IC50為0.071±0.013mg

4、/L，檢出限(IC1o)為1.28±0.8yg/L，線性檢測(cè)范圍為0.005-5mg/L。平均板內(nèi)變異系數(shù)在1.82％-4.48％之間，板間變異系數(shù)在3.22％-8.74％之間。在交叉反應(yīng)測(cè)定中，除烯效唑有一定的交叉反應(yīng)外，與三唑類殺菌劑戊唑醇、己唑醇、三唑酮、粉唑醇、氟環(huán)唑、環(huán)唑醇都沒(méi)有明顯的交叉反應(yīng)。對(duì)烯效唑ic-ELISA的分析條件進(jìn)行了優(yōu)化，確定了20％甲醇、0.3mol/LNa+強(qiáng)度、pH7.5作為分析的最佳工作條件。在優(yōu)化條

5、件下，該方法的線性范圍為0.005-10mg/L,IC50為2.26±0.5mg/L，檢出限為1.82±0.83yg/L。平均板內(nèi)變異系數(shù)在1.82％-5.05％之間，板間變異系數(shù)在1.93％-7.49％之間，方法的精密度較好。制備的抗烯效唑抗體除與烯唑醇有一定的交叉反應(yīng)外，與戊唑醇、己唑醇、三唑酮、粉唑醇、氟環(huán)唑、環(huán)唑醇交叉反應(yīng)較小。
　　 以建立的烯唑醇ic-ELISA分析方法，考察了不同樣品基質(zhì)對(duì)ELISA測(cè)定的影響，樣品

6、經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單的提取凈化步驟，最終提取物用緩沖液稀釋1-4倍之后，樣品中的基質(zhì)基本不影響測(cè)定，可用于水、土壤、梨、葡萄、番茄、面粉等樣品的檢測(cè)，添加濃度為0.005mg/L(mg/kg)-0.5mg/L(mg/kg)，測(cè)得添加回收率在70％-120％之間，變異系數(shù)在0.33％-10.42％之間。用建立的烯效唑ic-ELISA分析方法測(cè)定了水和土壤中的烯效唑殘留量，添加濃度為0.005mg/L(mg/kg)-0.5mg/L(mg/kg)之間時(shí)，