基于甘藍(lán)型油菜小孢子培養(yǎng)和胚狀體誘導(dǎo)的植株再生、轉(zhuǎn)化與誘變體系的構(gòu)建.pdf

1、1.本試驗(yàn)研究了不同因素對兩個(gè)甘藍(lán)型油菜品種浙雙758和浙雙72的小孢子出胚率和胚狀體不定芽再生率的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明,30℃暗培養(yǎng)2天后轉(zhuǎn)入24℃下培養(yǎng),具有較高的正常胚產(chǎn)率。在活性炭濃度為0.25 mg/ml時(shí),兩品種的小孢子胚產(chǎn)率最高。當(dāng)蔗糖濃度為130g/L時(shí),兩個(gè)品種的小孢子正常胚產(chǎn)率均為最高。在固體培養(yǎng)基上接種兩個(gè)品種不同胚齡的小孢子胚,發(fā)現(xiàn)胚齡對芽再生率和再生外植體芽數(shù)有顯著的影響。以4周胚齡,即子葉期的胚狀體芽再生率最大

2、。研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)激素BA和NAA的配比濃度為0.3mg/L和2mg/L時(shí),浙雙758和浙雙72兩品種的芽再生率達(dá)到最大。GA濃度對甘藍(lán)型油菜胚再生不定芽有顯著的影響。其中以添加0.1mg/L GA不定芽再生能力最強(qiáng),浙雙758和浙雙72兩品種芽再生率分別達(dá)到82.5％和79.4％。
　　 2.本研究利用秋水仙素直接處理再生植株根系,研究秋水仙素對再生植株加倍效率的影響。結(jié)果表明,甘藍(lán)型油菜小孢子再生植株一般以單倍體植株為主,自發(fā)二

3、倍體植株數(shù)次之。流式細(xì)胞儀(FCM)倍性分析表明,不同濃度的秋水仙素(150、300mg/L)對甘藍(lán)型油菜均有不同程度的加倍效果,處理后的再生植株平均二倍體率達(dá)到40％以上。采用合適的加倍劑濃度對于染色體加倍有利,如采用過高的秋水仙素濃度則會對植物細(xì)胞產(chǎn)生毒害,如采用過低的濃度又達(dá)不到較好的加倍效果.本實(shí)驗(yàn)還研究了熒光素二乙酸酯(FDA)氣孔保衛(wèi)細(xì)胞熒光染色來鑒定小孢子再生植株的倍性。通過對大量材料進(jìn)行熒光染色顯微觀察,發(fā)現(xiàn)單倍體植株的

4、氣孔細(xì)胞顯著小于二倍體或?qū)φ?同時(shí)密度要高于二倍體或?qū)φ铡?br>　　 3.本研究在臺灣大學(xué)葉開溫教授實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的雙價(jià)抗蟲基因(sporamin和chitinase)表達(dá)載體的基礎(chǔ)上,進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)抗性基因轉(zhuǎn)化,添加羧芐青霉素具有抑制農(nóng)桿菌的生長以降低農(nóng)桿菌對受體造成深度傷害。結(jié)果發(fā)現(xiàn),甘藍(lán)型油菜胚狀體對高濃度的羧芐青霉素(>500 mg/L)較為敏感,在細(xì)菌被殺死的同時(shí),正常的生長細(xì)胞也逐漸褐化,最終死亡。本實(shí)驗(yàn)通過設(shè)定不同濃度的潮

5、霉素濃度,未經(jīng)轉(zhuǎn)化的胚狀體愈傷組織在含有大于5mg/L潮霉素的分化培養(yǎng)基中愈傷組織全部褐化死亡,不能再生出芽,而添加相對較低濃度的潮霉素(2.5mg/L)的篩選分化培養(yǎng)基中,未經(jīng)轉(zhuǎn)化的胚狀體仍有再生苗產(chǎn)生。此外,在油菜轉(zhuǎn)化中,在生根培養(yǎng)基中添加100mg/L的頭孢霉素能有效抑制農(nóng)桿菌的生長,同時(shí)能最大限度的降低抑菌素本身對再生苗生根的影響。將雙價(jià)抗蟲基因?qū)胧荏w,經(jīng)PCR檢測已初步獲得轉(zhuǎn)基因植株。
　　 4.本研究試圖通過基因槍

6、介導(dǎo)方式將雙價(jià)抗蟲基因轉(zhuǎn)殖到甘藍(lán)型油菜中,篩選獲得了生長正常的轉(zhuǎn)基因植株,期望可以得到高效能的抗蟲轉(zhuǎn)基因植株來減少農(nóng)藥的使用量。結(jié)果表明,對胚狀體進(jìn)行預(yù)培養(yǎng),其基部膨大,代謝活動較旺盛,可提高胚狀體受轟擊的面積、子彈的利用率及外源DNA整合機(jī)率,從而可適當(dāng)提高轉(zhuǎn)化效率。此外,研究表明轟擊2次比轟擊1次抗性胚狀體數(shù)多,可能是基因槍轟擊是隨機(jī)的,轟擊2次比轟擊1次概率大。據(jù)此建立了甘藍(lán)型油菜小孢子胚狀體的轉(zhuǎn)化體系,將雙價(jià)抗蟲基因整合到胚狀體

7、中,經(jīng)初步檢測已獲得轉(zhuǎn)基因植株。
　　 5.本研究基于油菜小孢子高效胚胎發(fā)生技術(shù),利用EMS誘變與ZJ0273選擇培養(yǎng),篩選抗除草劑ZJ0273的再生植株,并對再生植株進(jìn)行除草劑抗性檢驗(yàn),獲得了一些抗性植株。結(jié)果表明,EMS濃度越大、誘變時(shí)間越長,胚狀體受到的毒害作用也越大。本試驗(yàn)選擇了半致死劑量誘變后的胚狀體進(jìn)行ZJ0273選擇培養(yǎng),進(jìn)行植株再生?？剐越Y(jié)果表明,在較高濃度ZJ0273(100mg/L)培養(yǎng)基中篩選得到的再生植株

8、,具有較高的抗性比例。由沒經(jīng)過選擇培養(yǎng)獲得再生植株進(jìn)行除草劑噴施可看出,只有極少量的植株在噴施100mg/L ZJ0273后能夠存活。由此可見,在正常情況下利用除草劑ZJ0273篩選抗性植株的效率非常低,而運(yùn)用本研究的誘變與選擇培養(yǎng)進(jìn)行除草劑抗性篩選相對較高。
　　 6.為了從基因水平上探索乙酰乳酸合成酶(ALS)和酮醇酸還原異構(gòu)酶(KARI)對草劑敏感性表現(xiàn)差別的原因,本研究通過添加不同濃度丙酯草醚(產(chǎn)品代號ZJ0273)于培

9、養(yǎng)基中,結(jié)合對不同處理時(shí)間胚狀體樣品的熒光定量PCR檢測,探討了油菜小孢子胚狀體分化過程中ALS和KARI基因的表達(dá)含量差異及其響應(yīng)特征。研究表明,添加高濃度的ZJ0273對油菜ALS酶活有一定的抑制作用,且隨著處理時(shí)間的延長,酶活力降低,對ALS酶的抑制作用增加。而對照和在低濃度處理下,胚狀體存活率無顯著變化,有正常的分化能力。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),ZJ0273對油菜胚狀體中的ALS基因和KARI基因的調(diào)控因其濃度高低和處理時(shí)間不同而異。在高