狗魚(yú)幼魚(yú)彈狀病毒的特性、基因組測(cè)序及分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)研究.pdf

1、狗魚(yú)幼魚(yú)彈狀病毒(Pike fry rhabdovirus,PFRV)是一種與鯉春病毒血癥病毒(Spring viraemia of carp virus,SVCV)同源性很高的病毒,目前還未引起人們高度重視。為了對(duì)PFRV有一個(gè)較全面的了解,對(duì)該病毒今后的監(jiān)測(cè)奠定基礎(chǔ),本論文測(cè)定了PFRV的生物學(xué)特性,克隆并測(cè)序了其全基因組序列,并嘗試建立RT-PCR(Reverse transcription polymerase chain re

2、action,RT-PCR)、實(shí)時(shí)熒光RT-PCR(Realtime RT-PCR)及RT-LAMP(Reverse transcription loop-mediated isothermalamplification,RT-LAMP)3種檢測(cè)方法。
　　 1、PFRV的生物學(xué)特征。PFRV能在銅吻磷鰓太陽(yáng)魚(yú)成纖維細(xì)胞(Blue gill fry,BF-2)、鮭魚(yú)胚胎細(xì)胞(Chinook salmon embryo,CHSE)

3、、鯉魚(yú)上皮瘤細(xì)胞(Epitheliomapapulosum cyprinid,EPC)、肥頭鯉細(xì)胞(Fathead minnow,FHM)和草魚(yú)性腺細(xì)胞(Overy of grass carp,CO)上復(fù)制,產(chǎn)生明顯的細(xì)胞病變效應(yīng)(Cytopathogenic effect,CPE)；PFRV在BF-2細(xì)胞中的適宜復(fù)制溫度為15℃-25℃；理化性質(zhì)測(cè)定表明,氯仿處理、pH3處理60 min、50℃水浴30 min,病毒徹底滅活,但病毒對(duì)

4、DNA抑制劑(5’-碘-2’-去氧尿嘧啶,5-iodo-2’-deoxyuridine,IUdR)處理不敏感；細(xì)胞超薄切片電鏡觀察顯示病毒粒子呈典型的彈狀,大小為105 nm-130 nm×60 nm-70nm；SDS-PAGE電泳顯示病毒含有5個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白,其分子量分別為165 kDa,65 kDa,46 kDa,38 kDa和29 kDa。
　　 2、PFRV全基因組序列的克隆、測(cè)序及分子進(jìn)化分析。本研究共設(shè)計(jì)10對(duì)簡(jiǎn)并引物,

5、4對(duì)特異性引物及2套cDNA末端快速擴(kuò)增(Rapid-amplification of cDNAends,RACE)引物擴(kuò)增PFRV全基因組序列,獲得了16個(gè)相互重疊的克隆,測(cè)得序列拼接后確定PFRV的全基因組序列為11097個(gè)核苷酸。序列分析表明PFRV全基因組含有5個(gè)基因,基因間有間隔序列,在基因組的3’和5’端分別有前導(dǎo)序列和拖尾序列。參考其他彈狀病毒,這5個(gè)開(kāi)放閱讀框(Open reading frame,ORF)編碼的5個(gè)蛋白

6、分別為核蛋白(Nucleoprotein,N)、磷酸化蛋白(Phosphoprotein,P)、基質(zhì)蛋白(Matrix protein,M)、糖蛋白(Glycoprotein,G)和RNA依賴的RNA聚合酶蛋白(RNA-dependent RNA polymerase protein,L),在基因組中的排列順序?yàn)?’N-P-M-G-L5’。PFRV全基因組序列已經(jīng)被Genebank接受,收錄號(hào)為FJ872827。PFRV5個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄起

7、始信號(hào)和轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)分別與其他水皰性口膜炎病毒的相應(yīng)信號(hào)相同。PFRV3’端和5’端序列反向互補(bǔ),且分別與水皰性口膜炎病毒的相應(yīng)序列有很高的同源性。
　　 氨基酸序列兩兩比對(duì)顯示:在4個(gè)動(dòng)物彈狀病毒屬中,PFRV編碼的5個(gè)蛋白均與水皰性口膜炎病毒同源性最高,特別是SVCV,同源性分別為91.4％(N)、55.3％(P)、76.6％(M)、70.7％(G)和87.8％(L)。依據(jù)動(dòng)物彈狀病毒N、P、M和G蛋白的全長(zhǎng)氨基酸序列以及L

8、蛋白的blockⅢ氨基酸序列構(gòu)建5個(gè)蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù),5個(gè)進(jìn)化樹(shù)均顯示PFRV與SVCV聚為一支,然后再與水皰性口膜炎病毒正式種類聚為一支,最后與彈狀病毒903/87(Rhabdovirus903/87,903/87)、海龜彈狀病毒28/97(Sea trout rhabdovirus28/97,STRV)和胭脂魚(yú)彈狀病毒(Chinese suckerrhabdovirus,SCRV)聚集。
　　 3、RT-PCR檢測(cè)方法。依據(jù)

9、PFRV G基因保守序列,設(shè)計(jì)2對(duì)特異性引物。對(duì)RT-PCR的反應(yīng)組分Mg2+、dNTP、引物濃度及反應(yīng)的退火溫度、循環(huán)數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。按照優(yōu)化好的RT-PCR條件進(jìn)行特異性試驗(yàn)和靈敏度試驗(yàn),結(jié)果顯示:檢測(cè)傳染性造血器官壞死病毒(Infectious haematopoietic necrosis virus,IHNV)、SVCV、病毒性出血性敗血癥病毒(Viral haemorrhagic septicaemia virus,VHSV)、

10、病毒性神經(jīng)壞死病毒(Virus nervous necrosis virus,VNNV)、傳染性胰臟壞死病毒(Infectious pancreaticnecrosis virus,IPNV)、牙鲆彈狀病毒(Hirame rhabdovirus,HRV)和PFRV時(shí),只有PFRV擴(kuò)增產(chǎn)物電泳出現(xiàn)特征條帶；檢測(cè)PFRV的靈敏度為102.5TCID50。
　　 4、實(shí)時(shí)熒光RT-PCR。根據(jù)PFRV G基因保守序列,設(shè)計(jì)1條特異性T

11、aqman熒光探針和1對(duì)特異性引物。對(duì)實(shí)時(shí)熒光RT-PCR的引物和探針濃度及反應(yīng)的退火溫度進(jìn)行優(yōu)化。按照優(yōu)化好的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR條件進(jìn)行特異性試驗(yàn)和靈敏度試驗(yàn),結(jié)果顯示:檢測(cè)IHNV、SVCV、VHSV、VNNV、IPNV、HRV和PFRV時(shí),只有PFRV樣品檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性；檢測(cè)PFRV的靈敏度為101.5TCID50。
　　 5、RT-LAMP。依據(jù)PFRV G基因6個(gè)區(qū)域,設(shè)計(jì)1套特異性LAMP引物(2條內(nèi)引物,2條外引

12、物)；對(duì)反應(yīng)溫度及時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化,確定最優(yōu)反應(yīng)條件為63℃恒溫反應(yīng)60 min。按照優(yōu)化好的RT-LAMP條件進(jìn)行特異性試驗(yàn)和靈敏度試驗(yàn),結(jié)果顯示:檢測(cè)IHNV、SVCV、VHSV、VNNV、IPNV、HRV和PFRV時(shí),只有PFRV的檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性；RT-LAMP檢測(cè)PFRV的靈敏度為100.5TCID50,比用RT-PCR檢測(cè)的靈敏度高100倍,比用實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)的靈敏度高lO倍。
　　 然而,這3種PFRV分子生物