真姬菇AFLP分子標(biāo)記的建立和遺傳多樣性分析及釀酒酵母細(xì)胞絮凝主效基因的定位克隆.pdf

1、闡明復(fù)雜性狀的遺傳機(jī)制是動(dòng)植物、微生物遺傳改良以及人類復(fù)雜疾病致病機(jī)理研究的重要基礎(chǔ)。復(fù)雜性狀遺傳解析的重點(diǎn)是定位控制復(fù)雜性狀遺傳的數(shù)量性狀基因座(quantitative trait loci, QTL)，檢測(cè)QTL之間的相互作用，進(jìn)而鑒定相應(yīng)的候選基因。QTL定位分析要求整合遺傳標(biāo)記、表型數(shù)據(jù)和作圖群體遺傳結(jié)構(gòu)3個(gè)方面的信息。本研究以真菌作為研究材料，首先從食用真菌真姬菇入手，通過(guò)建立AFLP分子標(biāo)記，為真姬菇遺傳圖譜構(gòu)建和QTL定

2、位分析奠定基礎(chǔ)；通過(guò)菌株遺傳多樣性分析，為揭示真姬菇群體遺傳結(jié)構(gòu)提供第一步參考，并為作圖群體的親本選擇提供可靠依據(jù)。
　　 由于食用菌基因組結(jié)構(gòu)復(fù)雜且遺傳信息匱乏，對(duì)真姬菇繼續(xù)開展復(fù)雜性狀遺傳基礎(chǔ)研究困難重重。為此，接下來(lái)本文創(chuàng)造性地利用釀酒酵母這一簡(jiǎn)單的模式真核生物對(duì)復(fù)雜性狀遺傳變異的分子基礎(chǔ)進(jìn)行解析，通過(guò)研究為系統(tǒng)解決數(shù)量遺傳學(xué)的核心問(wèn)題提供分析框架，并為包括真姬菇等食用菌品種在內(nèi)的動(dòng)植物及微生物復(fù)雜性狀研究提供理論和方法參

3、考。
　　 真姬菇(Hypsizygus marmoreus(Peck) H.E.Bigelow)，又稱玉蕈、斑玉蕈、鴻喜菇和蟹味菇等，隸屬于擔(dān)子菌門、傘菌綱、傘菌目、白蘑科、玉蕈屬。真姬菇是一種珍稀食用菌品種，具有味道鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富的食用價(jià)值和抗真菌、抗腫瘤等藥用價(jià)值，因此具有良好的市場(chǎng)前景。國(guó)內(nèi)外對(duì)于真姬菇的研究主要集中在營(yíng)養(yǎng)生理生化和藥理作用等方面，對(duì)于真姬菇分子生物學(xué)和遺傳學(xué)研究鮮有報(bào)導(dǎo)。建立有關(guān)真姬菇生產(chǎn)用菌種的分子遺

4、傳標(biāo)記，并創(chuàng)立相應(yīng)的菌種檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)與方法，是保護(hù)我國(guó)真姬菇品種知識(shí)產(chǎn)權(quán)的重要途徑。
　　 本研究首先旨在建立一套可靠的AFLP（amplified fragment length polymorphism）分子標(biāo)記實(shí)驗(yàn)方案對(duì)真姬菇進(jìn)行基因分型，并對(duì)包括工廠化栽培品種和保藏品種在內(nèi)的19個(gè)真姬菇菌株進(jìn)行DNA指紋圖譜構(gòu)建和遺傳多樣性分析。主要研究結(jié)果如下：
　　 1、真姬菇AFLP分子標(biāo)記的建立
　　 真姬菇多糖和蛋

5、白含量較高，這為其基因組DNA的提取帶來(lái)困難。為了制備符合AFLP標(biāo)記技術(shù)要求的高質(zhì)量DNA，我們對(duì)普遍應(yīng)用于植物材料的十六烷基三乙基溴化銨（cetyltriethylammonium bromide, CTAB）法進(jìn)行修改，建立了適合真姬菇的有效的DNA提取方法。
　　 AFLP分析采用的限制性內(nèi)切酶組合是EcoRI和MseI。通過(guò)對(duì)選擇性堿基種類和數(shù)目以及引物組合進(jìn)行篩選，最終確定10對(duì)引物組合（Eco Rl+2nt/Mse

6、I+3nt）用于多態(tài)性檢測(cè)。運(yùn)用10對(duì)引物在19個(gè)基因型中共擴(kuò)增得到609個(gè)AFLP標(biāo)記位點(diǎn)，其中多態(tài)性位點(diǎn)為532個(gè)，多態(tài)性比率為87％。每對(duì)引物擴(kuò)增的標(biāo)記總數(shù)從47到80不等（平均標(biāo)記數(shù)為60.9），但各引物組合多態(tài)信息量(polymorphic information content,PIC)很高，其中PIC最高達(dá)到92％。另外，除去由試驗(yàn)誤差造成的缺失數(shù)據(jù)，10對(duì)引物在19個(gè)基因型中共檢測(cè)到11184個(gè)標(biāo)記數(shù)據(jù)點(diǎn)。以上數(shù)據(jù)表明：

7、(1)真姬菇物種具有豐富的遺傳差異和遺傳多樣性；(2)10對(duì)引物都具備較好的多態(tài)性檢出能力，可作為今后試驗(yàn)（如遺傳圖譜構(gòu)建）的候選引物；(3)豐富的多態(tài)性位點(diǎn)和標(biāo)記數(shù)據(jù)點(diǎn)的獲得證明本研究建立的AFLP標(biāo)記技術(shù)能夠有效地應(yīng)用于真姬菇的遺傳學(xué)研究。
　　 2、19個(gè)真姬菇菌株遺傳多樣性評(píng)價(jià)
　　 采用Dice相似系數(shù)分析和UPGMA法對(duì)19個(gè)真姬菇菌株的遺傳相似性進(jìn)行聚類分析。聚類結(jié)果表明，HmC1199等6個(gè)菌株在相似系數(shù)

8、大于等于0.95處聚為類群一；另有HmC2637等7個(gè)菌株在相似系數(shù)大于等于0.92處聚為類群二；其余6個(gè)菌株與兩個(gè)類群的遺傳差異相對(duì)較大，尤其是菌株HmJ2632與HmC1199的相似系數(shù)僅為0.547。同時(shí)，采用主成分分析（principal component analysis, PCA）對(duì)19個(gè)真姬菇菌株的遺傳多樣性作進(jìn)一步分析和驗(yàn)證，第一和第二主分揭示出與UPGMA聚類分析一致的結(jié)果。
　　 將19個(gè)真姬菇菌株遺傳分類

9、的結(jié)果與形態(tài)學(xué)特征作比較，發(fā)現(xiàn)同一類群的菌株的子實(shí)體形態(tài)具有共同特點(diǎn)，如類群一，菇蓋小、菌柄細(xì)；類群二，菇蓋大、菌柄短而粗。據(jù)此可以把19個(gè)菌株劃分為4個(gè)代表類別：即除兩個(gè)類群外，還包括白色菇蓋品種(HmJ3136)和瘤蓋品種(HmJ2632)。盡管我們尚不了解真姬菇菇蓋性狀的遺傳基礎(chǔ)，但是克隆這個(gè)白色菇蓋品種(HmJ3136)的白化基因并將其與其它菌株正?；蜃鞅容^，無(wú)疑將是一個(gè)正確的選擇和起點(diǎn)。而瘤蓋品種(HmJ2632)與其余18

10、個(gè)菌株遺傳差異非常大，借鑒其他菌種子實(shí)體結(jié)實(shí)溫度的研究結(jié)論，我們認(rèn)為，真姬菇可能存在與香菇類似的子實(shí)體結(jié)實(shí)類型（fruiting season type），其中瘤蓋品種(HmJ2632)可能屬于高溫型，而其余18個(gè)菌株則可能分別屬于中溫或低溫型。
　　 目前，在復(fù)雜性狀遺傳結(jié)構(gòu)解析方面，人類和動(dòng)植物作圖群體中有效減數(shù)分裂量的匱乏極大地限制了QTL定位的解析率，研究者將目光更多地投向模式生物。釀酒酵母（Saccharomyces

11、cerevisiae）是適用于數(shù)量遺傳學(xué)研究的一個(gè)重要的真核模式物種。酵母絮凝是一個(gè)可逆的、無(wú)性的且依賴于鈣離子的過(guò)程，是指酵母細(xì)胞之間相互粘附形成聚集體(flocs)。絮凝特性與乙醇發(fā)酵生產(chǎn)密切相關(guān)，具有重要的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。研究表明，酵母FLO基因家族的多個(gè)FLO基因的遺傳變異和表達(dá)修飾可以導(dǎo)致絮凝表型的差異，這反映了絮凝這一性狀受多基因控制的復(fù)雜遺傳本質(zhì)。本研究采用正向遺傳學(xué)方法揭示釀酒酵母自然群體中細(xì)胞絮凝發(fā)生遺傳變異的分子基礎(chǔ)，

12、通過(guò)研究為包括真姬菇等食用菌品種在內(nèi)的動(dòng)植物及微生物復(fù)雜性狀研究提供理論和方法參考，并為用于發(fā)酵工業(yè)的酵母菌株的遺傳改良提供可靠的理論依據(jù)。
　　 主要研究結(jié)果如下：
　　 1、選擇兩個(gè)絮凝表型變異極其顯著的酵母菌株YH1A（非絮凝）和YL1C（絮凝）作為親本，通過(guò)兩親本雜交構(gòu)建了由292個(gè)子代個(gè)體組成的F2代單倍體分離群體(Huetal.，2007)。同時(shí)，構(gòu)建了以260個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記(STR)為主（Hu etal.，2

13、007）、24個(gè)SNP標(biāo)記為補(bǔ)充的酵母全基因組飽和分子標(biāo)記連鎖圖譜，標(biāo)記平均間隔在10-20cM范圍內(nèi)；
　　 2、建立了一套簡(jiǎn)便可靠的實(shí)驗(yàn)方法對(duì)親本及子代個(gè)體進(jìn)行絮凝表型測(cè)定。以液體培養(yǎng)基中細(xì)胞沉淀至管底所用時(shí)間(T)作為判定標(biāo)準(zhǔn)，并以兩個(gè)親本作為對(duì)照，絮凝表型一共劃分為四大類：第1類(T=0)；第Ⅱ類(0＜T＜=2.5)；第Ⅲ類(2.5＜T＜12.5)和第Ⅳ類(T＞＝12.5)。沉淀時(shí)間越長(zhǎng)，絮凝程度越低。親本YH1A和YL

14、1C分別屬于第Ⅳ類和第Ⅱ類，第1類個(gè)體表現(xiàn)出極端絮凝的超親分離現(xiàn)象。第1類至第Ⅳ類表型對(duì)應(yīng)的子代個(gè)體數(shù)分別是30、23、103和136個(gè)。由此，本研究將酵母絮凝作為一個(gè)具有多個(gè)閾值的分類性狀進(jìn)行處理；
　　 3、采用多區(qū)間作圖法定位到4個(gè)顯著的QTL，它們分別位于1號(hào)、2號(hào)、5號(hào)和15號(hào)染色體上。1號(hào)和5號(hào)染色體QTL區(qū)域分別包含一個(gè)已知的FLO基因FLO1和FLO8。通過(guò)精細(xì)定位，2號(hào)染色體QTL區(qū)域分解為6個(gè)候選基因，而15

15、號(hào)染色體QTL區(qū)域則包含8個(gè)候選基因；
　　 4、通過(guò)基因敲除、序列多態(tài)性分析、等位基因置換和定點(diǎn)突變等一系列試驗(yàn)，確證了位于2號(hào)染色體QTL區(qū)域的FPQ2是導(dǎo)致絮凝表型變異的一個(gè)主效基因。序列多態(tài)性分析和多序列比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩個(gè)親本YH1A和YL1C的FPQ2編碼區(qū)存在3個(gè)引起氨基酸錯(cuò)義突變的核苷酸變異，其中一個(gè)突變位點(diǎn)m3(D368V)在絮凝親本YL1C和7個(gè)其它酵母菌中具有高度保守性。經(jīng)過(guò)定點(diǎn)突變和突變型等位基因置換，我們

16、發(fā)現(xiàn)YL1C來(lái)源的m3位點(diǎn)能夠幾乎完全重建YL1C背景FPQ2基因敲除菌株的絮凝表型，可見(jiàn)m3位點(diǎn)的核苷酸多態(tài)是控制酵母絮凝的一個(gè)數(shù)量性狀核苷酸(QTN)。因此，F(xiàn)PQ2基因編碼區(qū)的DNA結(jié)構(gòu)變異是導(dǎo)致表型變異的一個(gè)重要原因。定量PCR和Western印跡分析結(jié)果表明，在兩個(gè)親本中FPQ2基因轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的表達(dá)量都存在顯著差異。采用與研究FPQ2相似的方法，我們鑒定出位于15號(hào)染色體QTL區(qū)域的FPQ15也是一個(gè)絮凝主效基因；

17、　　 5、本研究最終確定了4個(gè)絮凝QTL基因，包括兩個(gè)新基因：FPQ2和FPQ15，以及兩個(gè)已知的FLO基因：FLO1和FLO8，這些基因與3個(gè)方面有關(guān)：細(xì)胞發(fā)育（FPQ15）、子細(xì)胞行為（FPQ2）以及細(xì)胞表面黏附特性（FLO1和FLO8。其中，F(xiàn)PQ2的遺傳變異能夠解釋絮凝表型變異的25％，而FLO8、FLO1和FPQ15分別解釋表型變異的17％、11％和5％，4個(gè)基因型組合在一起能夠解釋表型變異的46％。為了說(shuō)明QTL基因的互作

18、效應(yīng)，我們根據(jù)每個(gè)子代個(gè)體的等位基因來(lái)源以及4個(gè)QTL基因型組合將292個(gè)個(gè)體分為16組。我們注意到，相比基因型為“----”（即4個(gè)等位基因FPQ2、FLO8、FPQ15和FLO1都來(lái)自YL1C）的一組個(gè)體，基因型“---+”（“+”表示等位基因來(lái)自YH1A）的一組中具有更大比例的個(gè)體表現(xiàn)出極端絮凝的表型。這就表明FLO1促進(jìn)絮凝的等位基因是來(lái)自YH1A親本的，也解釋了分離群體中的超親分離現(xiàn)象。QTL基因不同的等位基因組合使個(gè)體的表型