海洋微生物小分子代謝產(chǎn)物提取制備工藝研究.pdf

1、本論文主要是以海洋微生物發(fā)酵液為研究對(duì)象，探索海洋微生物小分子代謝產(chǎn)物高效率、高通量的提取和制備分離方法，建立海洋微生物小分子代謝產(chǎn)物餾分庫(kù)以供活性藥物的初步篩選，為最終建立海洋微生物小分子代謝產(chǎn)物活性化合物庫(kù)奠定基礎(chǔ)。具體內(nèi)容如下:
　　第一:為提高過(guò)濾速率，對(duì)海洋細(xì)菌和放線(xiàn)菌發(fā)酵液進(jìn)行預(yù)處理研究，主要以海洋細(xì)菌發(fā)酵液為研究對(duì)象，采用絮凝技術(shù)對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行預(yù)處理。以610nm透光率、蛋白去除率、多糖去除率、過(guò)濾速度等為指標(biāo)，從8種

2、不同類(lèi)型的絮凝劑中篩選出適合的絮凝劑，通過(guò)HPLC分析比較了兩種絮凝劑對(duì)發(fā)酵液中小分子代謝產(chǎn)物提取的影響，并探討了所篩選絮凝劑的使用條件。比較了4種固液分離方法對(duì)細(xì)菌發(fā)酵液的分離效果，進(jìn)而確定了適合海洋細(xì)菌發(fā)酵液快速預(yù)處理的工藝。結(jié)果表明:硫酸鋁耦合膜超濾法絮凝速度快、蛋白多糖去除率高、濾液澄清度好，不會(huì)造成粗提物中鋁離子的殘留量增加，適用于大部分海洋細(xì)菌發(fā)酵液的預(yù)處理。最佳使用pH值為6，在25℃-45℃之間溫度對(duì)其影響不大，發(fā)酵液中

3、蛋白含量與硫酸鋁用量存在一定的關(guān)系。通過(guò)驗(yàn)證，此法對(duì)放線(xiàn)菌發(fā)酵液預(yù)處理也是適宜的。
　　第二:以提取質(zhì)量和HPLC指紋圖譜為依據(jù)，對(duì)3類(lèi)不同類(lèi)型的13種大孔吸附樹(shù)脂進(jìn)行了篩選，以及組合搭配，通過(guò)質(zhì)譜分析探究將篩選出的3種不同類(lèi)型的樹(shù)脂串聯(lián)吸附是否具有優(yōu)勢(shì)，最后以254nm吸光值變化趨勢(shì)和HPLC跟蹤分析對(duì)串聯(lián)樹(shù)脂的吸附以及解吸條件進(jìn)行了初步探索。結(jié)果表明:將非極性大孔吸附樹(shù)脂DM11，中極性樹(shù)脂HPD400和極性樹(shù)脂SD3003種

4、不同類(lèi)型的樹(shù)脂串聯(lián)，可以盡可能多的吸附發(fā)酵液中的小分子代謝產(chǎn)物，并可以節(jié)約樹(shù)脂用量。DM11∶HPD400∶SD300較適宜的搭配比例約為2∶2∶3;確定的吸附條件為:吸附溫度為5℃，吸附pH值為5，上樣流速為4BV/h時(shí)較適宜，放線(xiàn)菌上樣量約為10BV，細(xì)菌約為32BV。確定的洗脫條件為:初步分段梯度點(diǎn)的甲醇水比例約為50∶50;洗脫體積為水洗2BV、20％甲醇洗2BV、50％甲醇洗1.8BV、純甲醇洗2BV;洗脫流速為1.5BV/h

5、較適宜。
　　第三:以分離度與分辨率為依據(jù)，從易分離極性化合物的四種高效液相分析色譜中篩選出了適宜的色譜柱，并對(duì)所篩選色譜柱的梯度條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明:柱4(NMUC18，4.6×250mm，5μ)適合分離海洋微生物發(fā)酵液粗提物，采用梯度條件3能較好的兼顧極性部分與非極性部分化合物的分離。并采用HPLC-PDA-ELSD和UPLC-PDA-Q-TOFMS兩套分析檢測(cè)系統(tǒng)分別對(duì)粗提物進(jìn)行指紋圖譜表征，給出盡可能多的物化信息。

6、r>　　第四:以色譜峰的可重現(xiàn)性、色譜柱裝填的可重復(fù)性以及色譜峰的分離度和峰形為指導(dǎo)依據(jù)，對(duì)干法與濕法兩種制備柱裝填方法的柱效進(jìn)行了考察;以尿嘧啶、硝基苯和芴3種標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)分析柱和制備柱進(jìn)行柱效評(píng)價(jià)，對(duì)分析條件與制備條件的轉(zhuǎn)化進(jìn)行了初步探究;以發(fā)酵液粗提物為對(duì)象考察了26×460mm制備柱的上樣量;最后對(duì)分段制備是否可解決分離度的問(wèn)題做了初步的考察。結(jié)果表明:制備柱采用干法裝填的效果比較好;26×460mm的制備柱適宜的流速為40mL/m