中國(guó)對(duì)蝦肝胰腺細(xì)小病毒(HPV-Pc)全基因組分析及其衣殼蛋白的表達(dá).pdf

1、對(duì)蝦肝胰腺細(xì)小病毒(Hepatopancreaticparvovirus，HPV)是世界各地養(yǎng)殖和野生對(duì)蝦的重要病原之一，隸屬于細(xì)小病毒科(Parvovirus)，細(xì)小病毒亞科(Parvoviridae)。它分布廣泛，雖然對(duì)對(duì)蝦的致死率不是很高，但能使中國(guó)明對(duì)蝦(Fenneropenaeuschinensis)、.斑節(jié)對(duì)蝦(Penaeusmonodon)等10多種對(duì)蝦生長(zhǎng)畸形，導(dǎo)致慢性矮小殘缺綜合癥(runt-deformitysynd

2、rome，RDS)，造成較大的經(jīng)濟(jì)損失。目前，GenBank已經(jīng)收錄了分離自泰國(guó)、印度、澳大利亞、韓國(guó)、馬達(dá)加斯加等地的HPV全長(zhǎng)或部分基因組序列。雖然中國(guó)大陸局部地區(qū)在養(yǎng)殖對(duì)蝦中檢測(cè)到了HPV，但未見其基因組序列的報(bào)道。且目前國(guó)內(nèi)外均沒(méi)有相關(guān)HPV功能基因的相關(guān)研究。本文首次克隆了中國(guó)地區(qū)對(duì)蝦HPV全基因組序列，并對(duì)其結(jié)構(gòu)蛋白進(jìn)行了表達(dá)、自組裝病毒樣顆粒(VLPS)機(jī)制的研究，進(jìn)而可以利用RNAi、抗體阻斷、競(jìng)爭(zhēng)抑制物、小分子藥效團(tuán)的

3、開發(fā)等基因工程、轉(zhuǎn)錄工程、蛋白質(zhì)工程以及新近的代謝工程技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)防治WSSV的感染。
　　 本研究主要包括3部分內(nèi)容：
　　 中國(guó)對(duì)蝦肝胰腺細(xì)小病毒HPV-Pc(河北分離株)全基因組序列的克隆及序列分析本論文首先利用RACE技術(shù)，根據(jù)已知的一段序列設(shè)計(jì)兩對(duì)正向、反向引物，通過(guò)DNA末端加尾和嵌套PCR克隆了HPV基因3’片段和5’片段序列，然后將3部分片段拼接后得到中國(guó)河北株HPV基因組序列。不同地區(qū)、不同對(duì)蝦HPV基因

4、組有較大差異，河北株HPV基因組長(zhǎng)6085nt，與其它已知序列同源性在78％～91％之間，差異遍布整個(gè)序列中。HPV基因組由兩末端非編碼序列和三個(gè)開放閱讀框(openreadingframe，ORF)構(gòu)成。三個(gè)ORF分別包括1384nt、1737nt和2466nt，預(yù)測(cè)分別編碼非結(jié)構(gòu)蛋白2(nonstructuralprotein2，NS2)、非結(jié)構(gòu)蛋白1(nonstructuralprotein1，NS1)和衣殼蛋白(capsidpr

5、otein，CP)，分子量分別為50kDa，66kDa和92kDa。2衣殼蛋白CP的原核重組質(zhì)粒pET30a-CP的構(gòu)建及其在E.coli中表達(dá)分析本實(shí)驗(yàn)基于河北株HPV的CP基因設(shè)計(jì)了一對(duì)引物，并引入BamHI和XhoI酶切位點(diǎn)，PCR擴(kuò)增出cp的基因片段，將全長(zhǎng)衣殼蛋白基因分別定向克隆到原核表達(dá)載體pET30a(+)，轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌EscherichiacoliBL21中，經(jīng)雙酶切、菌落PCR、測(cè)序鑒定，表明成功構(gòu)建了原核重組表達(dá)

6、載體pET30a(+)-CP。陽(yáng)性單克隆經(jīng)IPTG濃度梯度、溫度梯度誘導(dǎo)優(yōu)化表達(dá)條件，成功表達(dá)了氨基末端融合有6個(gè)組氨酸標(biāo)簽的衣殼蛋白，SDS-PAGE和WesternBlot分析在菌體裂解沉淀中可見97kDa左右的特異性條帶，而不同溫度誘導(dǎo)上清中均沒(méi)有特異性條帶出現(xiàn)，表明原核表達(dá)HPV重組衣殼蛋白(recombinantHPVcapsidprotein，rCP)以包涵體的形式表達(dá)，所以在變形條件下用金屬螯合親和層析柱對(duì)rCP進(jìn)行純化、

7、透析復(fù)性去除變性劑。電鏡觀察復(fù)性蛋白結(jié)果rCP可形成直徑約為22nm的完整或不完整病毒樣顆粒(virus-likeparticles，VLPs)，其外觀與已報(bào)道過(guò)的天然HPV病毒顆粒相似；通過(guò)SDS-PAGE后切膠大量制備重組蛋白rCP，經(jīng)Western-blot鑒定后作為抗原直接免疫小白鼠來(lái)制備抗CP的多克隆抗體。制備的抗血清經(jīng)Western-blot和ELISA法檢測(cè)抗體的特異性和效價(jià)。結(jié)果表明抗CP多克隆抗體能特異性識(shí)別rCP，效

8、價(jià)測(cè)定結(jié)果為1∶600。多抗的制備對(duì)于后續(xù)的CP活性蛋白的測(cè)定以及病毒樣顆粒的定性研究都有很重要的價(jià)值。
　　 3rCP的真核重組質(zhì)粒pEGFP-CP的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染人胚腎293T細(xì)胞、大菱鲆鰭條細(xì)胞的研究衣殼蛋白CP基因分別引入BamHI和Xhol酶切位點(diǎn)，將PCR擴(kuò)增的目的片段定向克隆到真核表達(dá)載體pEGFP-N1，經(jīng)酶切、菌落PCR鑒定后測(cè)序，表明成功構(gòu)建了真核表達(dá)質(zhì)粒EGFP-N1-CP。提取濃度大于2.5mg/ml的重組質(zhì)

9、粒后，分別轉(zhuǎn)染人胚腎293T細(xì)胞和大鯪鲆鰭條細(xì)胞，熒光顯微鏡能夠檢測(cè)到熒光產(chǎn)生，電鏡結(jié)果顯示，可溶性的rCP可形成數(shù)量不多的直徑約為22nm的病毒樣顆粒(virus-likeparticles，VLPs)，說(shuō)明rCP以可溶的形式得到表達(dá)?？梢钥闯觯琀PVVLPs的形成不需要HPV的其他蛋白及其DNA或RNA的參與，并且融合表達(dá)的His和GFP標(biāo)簽展示于VLPs的表面且不影響VLPs的形成g鑒于HPV與對(duì)蝦白斑綜合癥病毒(Whitespo