藏獒的起源、系統(tǒng)發(fā)育與遺傳多樣性研究.pdf

1、家犬是人類最親密的伙伴和朋友,也是人類第一個馴化的家養(yǎng)動物,有關(guān)家犬的起源、進化和品種形成等問題一直是各國學者研究的熱點之一,關(guān)于家犬的起源問題,目前已基本達成共識,即世界范圍內(nèi)的所有家犬都起源于灰狼。但是,關(guān)于家犬的起源地和具體起源時間研究結(jié)果并不一致,仍然存在較大的分歧。那么對目前世界上現(xiàn)存的古老犬種進行分析將是揭示家犬發(fā)源地和起源時間的有效方法。藏獒是目前世界上最古老、最兇猛的大型家犬品種之一,因此藏獒起源以及與其它家犬品種系統(tǒng)發(fā)

2、育關(guān)系的研究對于揭示家犬的起源、起源時間和起源地點都具有重要意義。但是目前藏獒的研究工作比較滯后,關(guān)于藏獒的起源、分類地位,以及與其它大型家犬品種間關(guān)系的研究報道較少。為了揭示藏獒的起源以及與其它家犬品種間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系,我們測定了藏獒線粒體基因組全序列,分析了藏獒線粒體基因組的基因組成、特征,以及與犬屬物種(家犬、灰狼和郊狼等)和哺乳動物的差異；利用線粒體基因組12個編碼蛋白基因、COI基因、DNA條形碼、控制區(qū)和高變區(qū)Ⅰ序列分析了藏

3、獒的起源、分類地位以及與其它家犬品種間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系,推測藏獒和家犬的起源時間；測定了藏獒群體控制區(qū)序列,利用控制區(qū)和538bp高變區(qū)Ⅰ序列分析了藏獒群體的遺傳多樣性。具體結(jié)果如下:
　　 (1)藏獒線粒體基因組全序列測定與分析
　　 通過克隆測序和序列拼接首次獲得了藏獒線粒體基因組全序列(GenBank序列號為HM048871),發(fā)現(xiàn)藏獒線粒體基因組全長16710bp,包括13個編碼蛋白基因、22個tRNA基因、2個r

4、RNA基因和1個非編碼區(qū)(即D-loop區(qū)),基因組成、排列方式和位置均與哺乳動物其他物種基本一致。藏獒線粒體基因組序列中T、C、A、G等4種堿基含量分別為28.7％、25.6％、31.6％和14.1％,其中AT含量(60.3％)明顯高于GC含量(39.7％).藏獒線粒體基因組13個編碼蛋白基因序列長度為11410bp,其中序列最長的基因為ND5(1821bp),最短的為ATPase8(204bp)；共發(fā)現(xiàn)4種起始密碼子,大多數(shù)編碼蛋白

5、基因(8個)均以ATG為起始密碼子,ND2、ND3和ND5基因以ATA為起始密碼子,ND6基因以AAT為起始密碼子,而ND4L基因以GTG為起始密碼子；11個編碼蛋白基因的終止密碼子為TAA,其中4個基因為不完全終止密碼子,而CytB基因和ND2基因的終止密碼子分別為AGA和TAG。藏獒線粒體基因組D-loop區(qū)序列全長為1250bp,定位在tRNA-Pro與tRNA-Phe之間,包括2個保守序列模塊即CSBⅠ和CSBⅡ,而在2個保守序

6、列模塊之間有一個短片段重復區(qū),這個重復區(qū)是由一個包含10個核苷酸構(gòu)成的重復單元5'-GTACACG T(G/A)C-3'經(jīng)過30個重復形成的.藏獒線粒體22個tRNA基因序列長度在66—75bp之間,總長度為1521bp,與引物源序列(家犬,GenBank序列號:U96639)tRNA的同源性為為99.08％,共有4個變異位點.藏獒線粒體12s rRNA和16s rRNA基因全長分別為954bp、1580bp,與與引物源序列的同源性為9

7、9.96％,僅發(fā)現(xiàn)1個變異位點,即在16s rRNA基因nt372位點發(fā)生了A/G轉(zhuǎn)換。
　　 (2)藏獒的起源及與其它家犬品種的系統(tǒng)發(fā)育分析
　　 采用NJ法、MP法和網(wǎng)絡(luò)法,分別根據(jù)線粒體基因組H鏈12個編碼蛋白基因、COI基因、DNA條形碼(648bp)、控制區(qū)和控制區(qū)582bp高變區(qū)Ⅰ等5種序列,結(jié)合我們測定的和GenBank中收錄的家犬、灰狼和郊狼的相應(yīng)序列,以郊狼為外類群,構(gòu)建了藏獒、家犬品種和灰狼的系統(tǒng)發(fā)育

8、樹和單倍型網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖,系統(tǒng)發(fā)育樹和網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖均顯示:藏獒、家犬品種與灰狼聚在一起,而外類群郊狼單獨聚為一類,說明藏獒和其它家犬一樣起源于灰狼；且藏獒與家犬品種間線粒體基因組5種序列的序列差異均小于藏獒與灰狼間的,而大于家犬品種間的,認為藏獒是家犬亞種中的一個品種,在動物分類地位上應(yīng)該隸屬于食肉目(Carnivora)、犬科(Canidae)、犬屬(Canis)、狼種(Canis lupus)、家犬亞種(Canis lupus famil

9、iaris).藏獒、家犬品種聚為4個分支,說明家犬至少有4個母系起源,與前人的研究結(jié)果基本一致；藏獒和部分的大型家犬品種如圣伯納犬、英國老式牧羊犬等屬于分支A,且藏獒與圣伯納犬、英國老式牧羊犬等大型家犬品種間的5種序列的序列差異、遺傳距離均最小,說明藏獒與圣伯納犬、英國老式牧羊犬等大型家犬品種問的親緣關(guān)系較近,從分子水平上證實了圣伯納犬、英國老式牧羊犬等大型犬在品種形成過程中可能摻入了藏獒的血統(tǒng)。
　　 利用Savolainen

10、等(2002)的方法,線粒體基因組H鏈12個編碼蛋白基因、COI基因、控制區(qū)和控制區(qū)582bp高變區(qū)Ⅰ的堿基替換率估計藏獒、家犬不同分支與灰狼間的分化時間.結(jié)果發(fā)現(xiàn):綜合考慮4個分支,家犬與灰狼間的分化時間分別為16000 YBP、32000 YBP、65000 YBP和50000 YBP,我們估計的家犬起源時間界于目前研究的最早的家犬起源時間(100000 YBP)和最晚的家犬起源時間(15000 YBP)之間,綜合各種因素,我們認為

11、家犬的起源時間至少在16000YBP,與Savolainen等(2002)、Pang等(2009)估計的家犬起源時間(分別為15000YBP、16300 YBP)一致,也符合根據(jù)化石推測的起源時間(26000 YBP)；藏獒的起源時間分別為18000 YBP、33000 YBP、68000 YBP和56000 YBP,均早于相應(yīng)序列估計的家犬起源,且系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)藏獒與一些古老的家犬品種(如英國老式牧羊犬等)聚為一類,序列差異和遺傳距

12、離均較小,與英國老式牧羊犬共享DNA條形碼單倍型,說明藏獒是目前世界上最古老的家犬品種之一。
　　 (3)藏獒群體遺傳多樣性分析
　　 通過克隆測序獲得了40個藏獒個體線粒體基因組控制區(qū)全序列,對藏獒控制區(qū)的結(jié)構(gòu)、控制區(qū)和538bp高變區(qū)Ⅰ序列的遺傳多樣性進行了分析,并與犬屬7個群體(金毛尋回獵犬、拉布拉多獵犬、伊利里亞牧羊犬、土耳其牧羊犬、中國灰狼、歐洲灰狼、郊狼)進行了比較。結(jié)果顯示:藏獒群體控制區(qū)全序列的長度從12

13、40bp到1320bp不等,其中主要的長度類型為1270bp(32.5％,13/40),進一步分析發(fā)現(xiàn)藏獒控制區(qū)全序列的長度多態(tài)性主要是由重復單元數(shù)量的不同引起的；在40個藏獒的控制區(qū)全序列中共檢測到75個變異位點,多態(tài)位點百分率為5.68％,其中單一多態(tài)位點14個,占多態(tài)位點總數(shù)的18.67％,簡約信息多態(tài)位點61個,占多態(tài)位點總數(shù)的81.33％；核苷酸變異類型中只有轉(zhuǎn)換、插入/缺失,沒有顛換出現(xiàn),表現(xiàn)出高度的轉(zhuǎn)換偏愛性；藏獒控制區(qū)全

14、序列的單倍型多樣度(H)為0.990,核苷酸多樣度(pi)為1.201,平均核苷酸差異數(shù)目(k)為13.082,均高于拉布拉多犬和金毛尋回獵犬群體,但與哺乳動物其他物種相比,核苷酸多樣度偏低。
　　 在犬屬8群體中,野生群體(中國灰狼、歐洲灰狼和郊狼)線粒體控制區(qū)538bp高變區(qū)Ⅰ序列的單倍型多樣度(H)、核苷酸多樣度和平均核苷酸差異數(shù)目均明顯高于5個家犬品種；在5個家犬品種內(nèi),土耳其牧羊犬的多態(tài)位點最多為21個(3.90％)、

15、其次是藏獒和伊利里亞牧羊犬,發(fā)現(xiàn)了19個多態(tài)位點(3.53％)；家犬品種289個個體共檢測到36個單倍型,其中29個單倍型為相應(yīng)品種特有,有7個共享單倍型；藏獒的單倍型多樣性最豐富,單倍型多樣度為0.854,而金毛尋回獵犬的單倍型多樣性最貧乏,單倍型多樣度為0.471；但是,藏獒的核苷酸多樣度和平均核苷酸差異數(shù)目最小,分別為0.845和4.519,伊利里亞牧羊犬的核苷酸多樣度最豐富(1.427)、平均核苷酸差異數(shù)目最大(7.661).藏