二、三倍體雌性虹鱒(Oncorhynchus mykiss)VG，SOX9，SOX9A2，DMRT1基因表達(dá)的比較研究.pdf

1、虹鱒Onchorynchus mykiss（Walbaum）是重要的冷水性養(yǎng)殖魚(yú)類。為提高產(chǎn)品的質(zhì)量和群體產(chǎn)量，近年來(lái)養(yǎng)殖人工誘導(dǎo)三倍體不育系虹鱒已成為一種發(fā)展趨勢(shì)。由于染色體多倍化，三倍體虹鱒的生殖機(jī)制發(fā)生了改變，甚至導(dǎo)致了三倍體虹鱒雌性不育。性腺是魚(yú)類進(jìn)行繁殖活動(dòng)的基礎(chǔ)，只有充分了解性腺發(fā)育和配子發(fā)生的規(guī)律，才能對(duì)魚(yú)類的繁殖過(guò)程更好地進(jìn)行調(diào)控。盡管有關(guān)三倍體虹鱒性腺發(fā)育已有一些研究，但主要集中于對(duì)其整個(gè)發(fā)育過(guò)程的組織學(xué)、細(xì)胞學(xué)、生殖

2、內(nèi)分泌學(xué)等的系統(tǒng)研究，尤其缺乏分子生物學(xué)水平的研究。
　　 三倍體雌性虹鱒卵巢發(fā)育經(jīng)歷了卵原細(xì)胞→卵黃發(fā)育前期卵母細(xì)胞→敗育的卵母細(xì)胞與卵原細(xì)胞簇共存→卵原細(xì)胞簇與類生精細(xì)胞囊共存→類生精細(xì)胞囊的過(guò)程，卵巢在發(fā)育的中后期具有類雄性化的趨勢(shì)。本研究以受精后10月齡和20月齡的二、三倍體雌性虹鱒為試驗(yàn)材料，采用流式細(xì)胞方法對(duì)其倍性進(jìn)行鑒定：采用波恩氏液固定、常規(guī)石蠟切片的方法觀察卵巢結(jié)構(gòu)及發(fā)育情況。以efla基因作為內(nèi)參，采用EVA

3、RE green實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)二、三倍體雌性虹鱒性腺發(fā)育過(guò)程中的Vg（卵黃蛋白原），Sox9a2（SRY-box containing gene9a2），Sox9（SRY-box containinggene9），Dmrtl（doublesex and mab-3-related transcription factor1）基因的表達(dá)（mRNA）情況進(jìn)行了比較研究，以探討三倍體雌性虹鱒類雄性化的分子機(jī)制。
　　 試驗(yàn)結(jié)

4、果表明：
　　 1.與二倍體相比，10月齡的三倍體雌性虹鱒卵巢發(fā)育未見(jiàn)明顯異常；20月齡的三倍體雌性虹鱒卵巢出現(xiàn)卵原細(xì)胞簇和類生精細(xì)胞囊共同存在的嵌合現(xiàn)象，并且在三倍體20月齡的卵巢中，存在因生殖細(xì)胞空泡化、溶解、壞死而形成的病灶區(qū)。
　　 2.三倍體雌性虹鱒中有內(nèi)源性Vg的少量合成。10月齡的三倍體雌性虹鱒，由于其去雌性化，Vg基因的相對(duì)表達(dá)量維持在一個(gè)很低的水平，僅是同時(shí)期二倍體表達(dá)量的0.12倍，且差異顯著（p<0

5、.05），而在20月齡時(shí)，由于雄性化的進(jìn)程加快，三倍體Vg的相對(duì)表達(dá)量更是極低，并顯著性地低于二倍體（p<0.05），僅是二倍體表達(dá)量的0.05倍。
　　 3.sox9a2基因與三倍體雌性虹鱒的性別分化似乎沒(méi)有直接的關(guān)系。10月齡時(shí)，三倍體雌性虹鱒sox9a2的表達(dá)量顯著性低于二倍體（p<0.05），僅是同時(shí)期二倍體表達(dá)量的0.08倍；在20月齡時(shí)，三倍體雌性虹鱒sox9a2的表達(dá)仍然顯著性低于二倍體（p<0.05），是同時(shí)期二

6、倍體表達(dá)量的0.05倍，也就是說(shuō)，三倍體雌性虹鱒sox9a2的表達(dá)在10月齡和20月齡中基本上是沒(méi)有太大的變化。
　　 4.Sox9基因在三倍體雌性虹鱒中與性別分化有關(guān)，支持其作為下游的基因起作用。10月齡三倍體雌性虹鱒中，Sox9基因的相對(duì)表達(dá)量顯著性增加（p<0.05），是同時(shí)期二倍體的7.16倍；而20月齡的三倍體雌性虹鱒中，雖然相對(duì)于10月齡來(lái)說(shuō)，Sox9基因的相對(duì)表達(dá)量有所降低，但仍然維持在一個(gè)較高的水平，是同期二倍體

7、的1.84倍（p<0.05）。
　　 5.Dmrtl基因與三倍體雌性虹鱒的雄性化有關(guān)，支持其作為上游基因起作用。相對(duì)于二倍體來(lái)說(shuō)，在10月齡，由于雄性化的開(kāi)始，Dmrtl基因的表達(dá)量在三倍體雌性虹鱒中開(kāi)始增加，且差異不顯著，是二倍體的1.14倍（p>0.05）；在20月齡中，因雄性化的進(jìn)程加快，其表達(dá)量激增，呈超表達(dá)趨勢(shì)，是同期二倍體表達(dá)量的14.5倍（p<0.05），Dmrtl基因可能激活Sox9基因，介導(dǎo)三倍體雌性虹鱒的雄性