家蠶腸道微生態(tài)產(chǎn)脂肪細(xì)菌的分離鑒定與差異性比較.pdf

1、昆蟲腸道系統(tǒng)是一個(gè)伴隨取食、消化、排泄等活動(dòng)而多變的微環(huán)境，其中寄居著大量的微生物，這些微生物在宿主的營(yíng)養(yǎng)、發(fā)育、生殖及對(duì)病原微生物的抗性中具有重要作用。相對(duì)于哺乳動(dòng)物，昆蟲腸道微生物功能的研究相對(duì)較慢，目前較為深入的研究?jī)H集中在一些特殊的類群如白蟻和沙漠蝗。這些微生物及其代謝產(chǎn)物對(duì)昆蟲宿主的生長(zhǎng)發(fā)育具有重要影響，如降解纖維素、生成甲烷、耗氫將CO2還原為乙酸鹽、固氮、維持較低的氧化還原勢(shì)能，同時(shí)在抵抗病原微生物的侵襲與定植中也起著重要

2、作用。然而，對(duì)其它種類昆蟲腸道微生物功能的研究則較少。鱗翅目昆蟲作為昆蟲綱的一個(gè)重要類群，目前僅有一些研究表明鱗翅目昆蟲腸道中棲息著大量的微生物菌群并且這些微生物可能產(chǎn)生消化酶為宿主提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。
　　 家蠶是鱗翅目昆蟲的模式生物，并且是一類具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的泌絲昆蟲。家蠶屬于寡食性昆蟲，主要以桑葉為食，但柘葉也可以作為其代用飼料。最近研究發(fā)現(xiàn)，4齡起蠶用柘葉替代桑葉飼養(yǎng)家蠶，家蠶不但生長(zhǎng)發(fā)育緩慢，而且極易感染家蠶核型多角體病毒

3、(BmNPV)。但是，有研究報(bào)道指出家蠶消化液中的脂肪酶具有較強(qiáng)的抗BmNPV活性。因此，本試驗(yàn)用柘葉飼養(yǎng)家蠶來構(gòu)建BmNPV敏感模型，采用分子生物學(xué)方法和常規(guī)傳統(tǒng)方法相結(jié)合的鑒定技術(shù)，以探討B(tài)mNPV敏感和不敏感家蠶其腸道優(yōu)勢(shì)菌、特別是脂肪酶產(chǎn)生菌的多樣性和差異性，為進(jìn)一步研究和探討家蠶抗病性與其腸道脂肪酶產(chǎn)生菌的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。
　　 試驗(yàn)結(jié)果如下：
　　 1.通過純培養(yǎng)分離方法從桑葉與柘葉飼養(yǎng)家蠶腸道中共獲得56株優(yōu)

4、勢(shì)菌。這些優(yōu)勢(shì)菌按照菌落形態(tài)和菌體特征可分為12類，其中桑葉飼養(yǎng)家蠶腸道中的優(yōu)勢(shì)菌表型有10類，柘葉飼養(yǎng)家蠶腸道中的優(yōu)勢(shì)菌表型有7類，它們共有的優(yōu)勢(shì)菌表型有4類。
　　 2.通過形態(tài)學(xué)、生理生化、16S rRNA基因序列測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)育分析，這12類優(yōu)勢(shì)菌分別屬于氣單胞菌屬(Aeromonas)、短桿菌屬(Brevibacterium)、棒桿菌屬(Corynebacterium)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、檸檬酸桿菌屬

5、(Citrobacter)、土壤桿菌屬(Agrobacterium)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、腸桿菌屬(Enterobacter)、寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)、短波單胞桿菌屬(Brevundimonas)和芽孢桿菌屬(Bacillus)。其中葡萄球菌屬(Staphylococcus)、腸桿菌屬(Enterobacte)、寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophom

6、onas)和短波單胞桿菌屬(Brevundimonas)4個(gè)類型是桑葉與柘葉飼養(yǎng)家蠶腸道中共有的優(yōu)勢(shì)菌群；氣單胞菌屬(Aeromonas)、短桿菌屬(Brevibacterium)、棒桿菌屬(Corynebacterium)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)和檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)5個(gè)類型是桑葉飼養(yǎng)家蠶腸道中特有的優(yōu)勢(shì)菌群；柘葉飼養(yǎng)家蠶腸道中特有的優(yōu)勢(shì)菌群僅有兩類，分別是土壤桿菌屬(Agrobacterium)和假單

7、胞菌屬(Pseudomonas)；而芽孢桿菌屬(Bacillus)只是4齡家蠶腸道中共有的優(yōu)勢(shì)菌類型。
　　 3.通過在羅丹明B瓊脂平板上篩選56株優(yōu)勢(shì)菌，從桑葉與柘葉飼養(yǎng)家蠶腸道中共獲得9株產(chǎn)脂肪酶的菌株。這9株脂肪酶產(chǎn)生菌經(jīng)鑒定分屬于6個(gè)菌屬，分別是芽孢桿菌屬(Bacillus)、短桿菌屬(Brevibacterium)、棒桿菌屬(Corynebacterium)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、克雷伯氏菌屬(K

8、lebsiella)和寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)。其中寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)是桑葉與柘葉飼養(yǎng)家蠶腸道中共有的脂肪酶產(chǎn)生菌，其它5個(gè)菌屬僅在桑葉飼養(yǎng)家蠶腸道中存在。結(jié)果顯示，不同飼料飼養(yǎng)家蠶其腸道脂肪酶產(chǎn)生菌的多樣性存在較大差異，柘葉飼養(yǎng)家蠶其腸道脂肪酶產(chǎn)生菌的類型遠(yuǎn)不如桑葉飼養(yǎng)家蠶腸道中的豐富。
　　 4.家蠶腸道脂肪酶產(chǎn)生菌通過在體外發(fā)酵培養(yǎng)48 h左右達(dá)到最大菌體濃度。然而，它