轉(zhuǎn)基因水稻桔桿中CrylAc蛋白降解的研究.pdf

1、轉(zhuǎn)Bt基因作物是全球商品化程度最快的轉(zhuǎn)基因作物之一，大面積種植轉(zhuǎn)Bt基因作物后，會(huì)產(chǎn)生大量的含有Bt殺蟲蛋白的植物秸稈，這些秸稈如果“秸稈還田”則使秸稈中含有的Bt殺蟲蛋白進(jìn)入土壤生態(tài)系統(tǒng)，造成Bt殺蟲蛋白在土壤中的累積，從而可能影響土壤生態(tài)系統(tǒng)的平衡。本實(shí)驗(yàn)試圖通過生物肥料發(fā)酵技術(shù)、高溫堿法以及沼氣發(fā)酵技術(shù)將轉(zhuǎn)Bt基因水稻秸稈中CrylAc蛋白降解。
　　 從全國不同土壤中篩選出9株能夠降解CrylAc蛋白的菌株，對(duì)降解效果最

2、好的菌株進(jìn)行了鑒定，并應(yīng)用在后續(xù)的試驗(yàn)中。利用該菌株進(jìn)行生物肥料發(fā)酵及沼氣發(fā)酵降解轉(zhuǎn)Bt基因水稻秸稈中CrylAc蛋白。通過單因素試驗(yàn)確定了利用生物肥料發(fā)酵技術(shù)降解轉(zhuǎn)Bt基因水稻秸稈中CrylAc蛋白的主要影響因素，在此基礎(chǔ)上，通過L9(34)正交設(shè)計(jì)及SAS分析對(duì)生物肥料生產(chǎn)過程中影響CrylAc蛋白降解的各個(gè)工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，從而使降解率得到了大幅度的提高。在利用沼氣發(fā)酵過程降解轉(zhuǎn)Bt基因水稻秸稈中CrylAc蛋白時(shí)，發(fā)現(xiàn)在沼氣生產(chǎn)

3、初級(jí)階段，CrylAc蛋白已基本完全降解。通過單因素實(shí)驗(yàn)確定了高溫堿法影響轉(zhuǎn)Bt基因水稻秸稈中CrylAc蛋白降解的主要因素，在此基礎(chǔ)上，通過L9(34)正交設(shè)計(jì)及SAS分析對(duì)高溫堿法影響CrylAc蛋白降解的各個(gè)工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，以較低成本使降解率達(dá)到100％。
　　 具體研究結(jié)果如下：
　　 1、從全國5種不同土壤中篩選出9株可降解Bt蛋白的菌株，分別將9株菌的0.1ml菌上清液加入到0.9ml的Bt蛋白上清液中，3

4、7℃，溫浴4h，兩者作用后經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳分析，130 kD對(duì)應(yīng)的Bt蛋白條帶均消失，經(jīng)多次重復(fù)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)菌株FJSB3可穩(wěn)定的降解Bt蛋白。對(duì)該菌進(jìn)行菌落形態(tài)觀察、電鏡觀察、生理生化試驗(yàn)以及16S rDNA序列克隆測定，初步判定FJSB3為寡養(yǎng)單胞菌屬細(xì)菌(Stenotrophomonas sp.)。
　　 2、通過單因素實(shí)驗(yàn)確定了影響生物肥料發(fā)酵過程中細(xì)菌FJSB3對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻秸稈中CrylAc蛋白降解的主要因素為

5、：發(fā)酵溫度，初始菌液濃度，pH值以及碳氮比(C/N)。再通過L9(34)正交表及SAS分析確定影響轉(zhuǎn)基因水稻秸稈中CrylAc蛋白降解率各因素主次關(guān)系依次為：C/N>初始菌液濃度>pH>溫度，并確定最優(yōu)參數(shù)組合：C/N為30/1、菌液濃度為2.0×106 CFU/ml、pH為6.0、溫度為33℃，在此條件下發(fā)酵4天時(shí)細(xì)菌FJSB3對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻秸稈中CrylAc蛋白的降解率為96.25％。
　　 3、將轉(zhuǎn)基因水稻秸稈與蒸餾水以1:

6、4(質(zhì)量比)比例混合，45℃濕潤1天。向預(yù)處理的轉(zhuǎn)基因水稻秸稈中噴灑沼氣發(fā)酵劑和尿素溶液以及FJSB3菌液，45℃下發(fā)酵8天時(shí)CrylAc蛋白降解率達(dá)到95.8％。說明在沼氣發(fā)酵初期階段未進(jìn)入發(fā)酵罐之前，轉(zhuǎn)基因水稻秸稈中CrylAc蛋白已基本完全降解。
　　 4、通過單因素實(shí)驗(yàn)確定了影響高溫堿法對(duì)水稻秸稈中CrylAc蛋白降解的主要因素為：溫度、pH值、熱處理時(shí)間。再通過L9(34)正交表及SAS分析確定影響水稻秸稈中CrylA