牛分支桿菌電化學(xué)免疫傳感器的研究.pdf

1、牛結(jié)核病(Bovine Tuberculosis)主要是由牛分支桿菌(Mycobacterium bovis，M.boris)引起的一種人獸共患慢性傳染病，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為B類動(dòng)物傳染病，我國將其列為二類動(dòng)物疫病。目前尚無有效的早期診斷試劑和保護(hù)性疫苗來預(yù)防該病。
　　 牛結(jié)核病嚴(yán)重影響動(dòng)物的健康，給畜牧業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失。該病可以通過乳制品等途徑傳染給人類，對(duì)人類的健康造成威脅。因此尋找一種快速檢測(cè)牛結(jié)核病的

2、方法，對(duì)預(yù)防和控制結(jié)核病也具有重要的意義。
　　 生物傳感器是近年迅速發(fā)展起來的快速診斷致病因素的一項(xiàng)新技術(shù)，此類檢測(cè)方法具有耗時(shí)少、敏感性及特異性高等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于疾病診斷、食品衛(wèi)生監(jiān)督、動(dòng)物疾(疫)病檢測(cè)、環(huán)境監(jiān)測(cè)等廣大領(lǐng)域中。免疫傳感器作為生物傳感器技術(shù)的一種，將電化學(xué)放大作用和免疫電極的特異性結(jié)合，使其不僅具有電化學(xué)分析的高靈敏度，還具有免疫識(shí)別的高特異性。因此本課題通過分離純化牛分支桿菌RCE融合蛋白，并以RCE蛋白

3、作為抗原制備了牛分支桿菌的單克隆抗體(McAb)，利用納米金功能化碳納米管敏感膜制備基于RCE抗原和M.bovis McAb兩種電化學(xué)免疫傳感器，用于牛結(jié)核病的診斷研究。
　　 主要研究內(nèi)容和結(jié)果：
　　 1.牛分支桿菌RV3872-cfp10-esat-6(以下簡稱RCE)融合蛋白的表達(dá)與純化利用表達(dá)載體pET-28a-RCE在大腸桿菌(E.coli BL21)中進(jìn)行表達(dá)，通過Ni-NTA親和層析柱純化分離出較高純度的

4、RCE融合蛋白；經(jīng)Brandford法測(cè)定RCE融合蛋白濃度為1.3910mg/ml；經(jīng)Western blot鑒定該蛋白具有較高的抗原活性。
　　 2.牛分支桿菌單克隆抗體的制備利用純化的RCE蛋白免疫Balb/c小鼠，采用雜交瘤技術(shù)，經(jīng)過5次細(xì)胞融合，利用自建立ELISA法篩選出3株能分泌單克隆抗體的陽性雜交瘤細(xì)胞5E5、5D5、5D7，并將5E5細(xì)胞注射Balb/c腹腔內(nèi)，制備了單克隆抗體抗腹水。正辛酸-硫酸銨法純化該單抗

5、腹水，獲得較高純度的單克隆抗體；經(jīng)紫外分光光度法測(cè)定該單抗?jié)舛葹?.089mg/ml；經(jīng)Western blot分析，該單克隆抗體具有良好的特異性，可以作為診斷抗體制備免疫傳感器，應(yīng)用于牛結(jié)核病的早期診斷研究。
　　 3.牛分支桿菌RCE融合蛋白免疫傳感器的研制電化學(xué)免疫傳感由于其靈敏度高，操作簡單、檢測(cè)快速等特點(diǎn)具有良好的應(yīng)用前景。本研究采用層層自組裝技術(shù)，將帶正電荷的硫堇(Thi)染料與帶負(fù)電荷的納米金顆粒(nano-Au)

6、通過靜電作用和共價(jià)鍵合作用吸附到Nafion-MWCNT膜修飾的玻碳電極(GCE)表面，制備了nano-Au/Thi/Nafion-MWCNT敏感膜，然后再通過nano-Au對(duì)蛋白的吸附作用，將RCE蛋白固定于電極表面，建立了基于牛分支桿菌RCE蛋白的電化學(xué)免疫傳感器，以循環(huán)伏安法(CV)作為免疫電極表征和定性判定的方法，測(cè)定免疫反應(yīng)前后還原峰電流下降的比例(k)，以實(shí)現(xiàn)對(duì)血清樣本中抗體的檢測(cè)。
　　 經(jīng)試驗(yàn)條件優(yōu)化，該傳感器的

7、最佳RCE抗原固定濃度為500μg/ml，抗原抗體反應(yīng)時(shí)間為60min。該免疫傳感器對(duì)RCE多克隆抗體具良好的響應(yīng)性能，其還原峰電流的降低率k隨著抗體濃度的降低而逐漸變小，在抗體稀釋度為1:80～1:2560范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，其線性回歸方程為k=3.875lnC+71.625，R=0.9976；該傳感器在靈敏性(RCE抗體在20480倍稀釋時(shí)，Elisa檢測(cè)不出陽性，而免疫傳感器能檢測(cè)出陽性)、特異性(RCE抗體引起的k值(47.1％)

8、遠(yuǎn)大于其他幾種桿菌引起的k值)、重復(fù)性(批內(nèi)和批間變異系數(shù)分別為1.51％和2.97％)方面都表現(xiàn)出良好的效果；通過對(duì)陰性血清的測(cè)定，初步建立了該免疫傳感器對(duì)牛分支桿菌感染陰陽性判定標(biāo)準(zhǔn)(k>15.4％判為陽性，k<15.4％判為陰性)，并用于牛血清樣品的檢測(cè)。其檢測(cè)結(jié)果與ELISA試劑盒檢測(cè)結(jié)果相符率為100％。此研究證明應(yīng)用電化學(xué)免疫傳感器實(shí)現(xiàn)對(duì)牛結(jié)核病的檢測(cè)是可行的，為進(jìn)一步改良并開發(fā)出臨床應(yīng)用型檢測(cè)牛結(jié)核病的免疫傳感器奠定了基礎(chǔ)