耐寒相關(guān)基因轉(zhuǎn)化華南木薯品種研究.pdf

1、木薯(Manihot esculenta Crantz)是世界熱帶亞熱帶地區(qū)重要的糧食與經(jīng)濟(jì)作物之一。傳統(tǒng)的育種方式為選育木薯良種方面作出了重要的貢獻(xiàn),但是由于木薯是高度雜合的特質(zhì)加上種質(zhì)資源的限制及常規(guī)育種方法的局限性,讓木薯進(jìn)一步的遺傳改良陷入困境。隨著分子生物學(xué)研究的深入,基因的鑒定、克隆、重組技術(shù)及轉(zhuǎn)基因技術(shù)的日趨成熟,利用基因工程手段進(jìn)行木薯遺傳改良,增強(qiáng)木薯抗病蟲(chóng)和耐逆境能力,提高木薯塊根產(chǎn)量,改善木薯淀粉品質(zhì)及降低有害物質(zhì)

2、的含量等,已成為木薯育種的一種有效手段。木薯是一種抗逆性比較強(qiáng)的熱帶、亞熱帶作物,但是地域性的適應(yīng)特性決定其不能忍受低溫的環(huán)境。通過(guò)農(nóng)桿菌法將抵抗逆境相關(guān)的基因引入木薯基因組,可以改善木薯的耐寒品質(zhì),使其能在較低溫度的環(huán)境中種植,為木薯北移或特異性區(qū)域種植提供品種保障。
　　 本研究以四個(gè)木薯優(yōu)良品種華南5號(hào)、6號(hào)、7號(hào)和8號(hào)為實(shí)驗(yàn)材料,進(jìn)行了以下方面的研究:建立了木薯無(wú)菌苗繁殖系統(tǒng);木薯體胚的循環(huán)誘導(dǎo)及體胚子葉再生培養(yǎng)條件研究

3、;消毒劑種類、取材時(shí)間及取材地點(diǎn)對(duì)木薯外植體消毒效果的影響;6-BA對(duì)木薯單芽莖段生長(zhǎng)的影響;2,4-D和picloram對(duì)不同品種木薯體胚發(fā)生能力的影響;體胚成熟時(shí)間對(duì)子葉植株再生能力的影響;建立了木薯遺傳轉(zhuǎn)化受體體系;利用建立的木薯遺傳轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng),采用農(nóng)桿菌(GV3101)介導(dǎo)對(duì)木薯體胚子葉進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化,并對(duì)共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)遺傳轉(zhuǎn)化的影響進(jìn)行研究;用六個(gè)植物表達(dá)載體對(duì)華南木薯優(yōu)良品種華南5號(hào)、6號(hào)和8號(hào)進(jìn)行轉(zhuǎn)化,并獲得再生植株共127

4、9株;對(duì)再生植株進(jìn)行抗性檢測(cè)及分子檢測(cè);將轉(zhuǎn)基因植株煉苗移栽至花盆,成功移栽了600多株苗;對(duì)轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行組培苗和盆栽苗的低溫處理鑒定其低溫脅迫下的適應(yīng)能力。主要研究結(jié)果如下:
　　 1.取材時(shí)間地點(diǎn)及消毒劑對(duì)木薯啟動(dòng)培養(yǎng)消毒影響效果不同,研究表明最佳的消毒方式是:取室內(nèi)培養(yǎng)的木薯外植體材料,經(jīng)過(guò)洗衣粉水浸泡10min,流水沖洗20min,75％酒精浸泡40s,0.1％HgCl2消毒10min,可達(dá)到很好的消毒效果,無(wú)菌率在9

5、0％以上。
　　 2.6-BA對(duì)抑制木薯頂端優(yōu)勢(shì)很明顯,濃度越高抑制越強(qiáng)。它不僅抑制木薯芽的徑向生長(zhǎng),也抑制根的徑向生長(zhǎng)。但是適宜的濃度可以促使木薯腋芽萌發(fā)產(chǎn)生叢生芽。對(duì)于需要木薯植株快速成苗的情況,以不添加任何激素的MS基本培養(yǎng)基培養(yǎng)效果最好。
　　 3.兩種激素2,4-D(8mg/l)和picloram(12mg/l)對(duì)四個(gè)木薯初級(jí)體胚的形成都有很強(qiáng)的促進(jìn)作用,其效果相當(dāng)。初級(jí)體胚繼代后除華南7號(hào)木薯外都能達(dá)到100

6、％的產(chǎn)胚率,而華南7號(hào)得木薯初級(jí)體胚卻在繼代后衰敗。
　　 4.CaCl2在木薯初級(jí)體胚的誘導(dǎo)過(guò)程中作用不明顯,而繼代后30d就有了明顯的結(jié)果,實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)范圍內(nèi)的高濃度CaCl2對(duì)繼代后的體胚形成有促進(jìn)作用。15mmol/l的CaCl2可以保持體胚100d的活力。
　　 5.成熟培養(yǎng)不同時(shí)間對(duì)木薯體胚子葉器官發(fā)生很有影響。成熟10～15d的木薯體胚子葉器官發(fā)生率比較好,誘導(dǎo)頻率在70％以上。
　　 6.華南木薯良好

7、的遺傳轉(zhuǎn)化體系:將培養(yǎng)10～15d的子葉胚盡量切小,用OD600在0.9～1.1之間的工程菌液進(jìn)行侵染45min,然后共培養(yǎng)3d后清洗去菌,轉(zhuǎn)到含500 mg/l羧芐青霉素和10mg/l潮霉素的低選擇壓器官發(fā)生培養(yǎng)基上進(jìn)行初篩及高抗菌素脫菌1周后,再進(jìn)行500mg/l羧芐青霉素和20mg/l潮霉素正常選擇壓器官發(fā)生培養(yǎng)基篩選2～3周。經(jīng)過(guò)兩次篩選的組織已有器官發(fā)生,選擇有芽器官的組織轉(zhuǎn)到莖器官伸長(zhǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)直到芽長(zhǎng)至1～2cm。切下芽

8、接種到無(wú)激素培養(yǎng)基上成苗培養(yǎng)。適量擴(kuò)繁轉(zhuǎn)化苗后,切取1～2cm頂端部分莖段進(jìn)行10mg/l潮霉素選擇壓生根篩選。對(duì)于選擇壓下有根形成的轉(zhuǎn)化株系再進(jìn)行后續(xù)的分子檢測(cè)。該體系適合華南5號(hào),6號(hào),8號(hào);但轉(zhuǎn)化效率略有差別。以華南8號(hào)得轉(zhuǎn)化效率最好,華南5號(hào)和華南6號(hào)效果相當(dāng)。
　　 7.通過(guò)PCR檢測(cè)的方法對(duì)篩選壓上形成的轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行了檢測(cè),共鑒定出:pVKH-35S-AtGolS2-pA轉(zhuǎn)基因木薯198個(gè)PCR陽(yáng)性株系,其中PCR為

9、陽(yáng)性且在篩選壓上生根的株系有81個(gè)。pVKH-35S-AtGolS2-ipt-pA轉(zhuǎn)基因木薯203個(gè)陽(yáng)性株系,其中PCR為陽(yáng)性且在篩選壓上生根的株系有79個(gè)。pVKH-35S-CBF3-pA轉(zhuǎn)基因木薯167個(gè)陽(yáng)性株系,其中PCR為陽(yáng)性且在篩選壓上生根的株系有50個(gè)。pCA-CP-CBF3-pA轉(zhuǎn)基因木薯123個(gè)陽(yáng)性株系,其中PCR為陽(yáng)性且在篩選壓上生根的株系有78個(gè)。pVKH-35S-AtGolS3-pA轉(zhuǎn)基因木薯309個(gè)陽(yáng)性株系,其中

10、PCR為陽(yáng)性且在篩選壓上生根的株系有93個(gè)。pCA-CP-CBF3-35S-AtGolS3-pA轉(zhuǎn)基因木薯104個(gè)陽(yáng)性株系,其中PCR為陽(yáng)性且在篩選壓上生根的株系有25個(gè)。
　　 8.通過(guò)RT-PCR對(duì)PCR為陽(yáng)性且篩選壓上可以生根的株系進(jìn)行對(duì)應(yīng)的檢測(cè)。結(jié)果得到pVKH-35S-AtGolS2-pA轉(zhuǎn)基因木薯65個(gè)陽(yáng)性株系;pVKH-35S-AtGolS2-ipt-pA轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性株系48個(gè);pVKH-35S-CBF3-pA轉(zhuǎn)基因

11、陽(yáng)性株系39個(gè);pCA-CP-CBF3-pA轉(zhuǎn)基因57個(gè)陽(yáng)性株系;pVKH-35S-AtGolS3-pA轉(zhuǎn)基因木薯64個(gè)陽(yáng)性株系;pCA-CP-CBF3-35S-AtGolS3-pA轉(zhuǎn)基因木薯20個(gè)陽(yáng)性株系。
　　 9.對(duì)部分RT-PCR結(jié)果為陽(yáng)性的植株進(jìn)行了PCR-southern雜交結(jié)果也為陽(yáng)性。這一系列的檢測(cè)進(jìn)一步證明了抗寒基因在實(shí)驗(yàn)的3個(gè)華南木薯品種中得以整合并表達(dá)。轉(zhuǎn)基因植株的基因組酶切Southern雜交正在探索中。

12、
　　 10.本文通過(guò)對(duì)木薯組培苗移栽基質(zhì)的選擇、移栽季節(jié)的選擇及苗的狀態(tài)方面的研究,表明適合木薯移栽的經(jīng)濟(jì)方法是:采用海南紅土+細(xì)沙(+腐殖土)=2:2(:1)作為栽培基質(zhì),選擇在每年的2～3月份,將培養(yǎng)1月的組培苗進(jìn)行水培閉口3d,開(kāi)口4d煉苗后,移栽,移栽后澆足定根水。通過(guò)此法,本研究成功移栽600多株木薯轉(zhuǎn)基因苗。本研究還發(fā)現(xiàn),對(duì)越冬木薯組培移栽苗進(jìn)行春季修剪,留下基本10cm左右主莖,可以促進(jìn)木薯苗的快速生長(zhǎng)。

13、　　 11.本研究對(duì)轉(zhuǎn)基因木薯組培苗及盆栽苗進(jìn)行了低溫處理檢測(cè)。通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)基因木薯組培苗和非轉(zhuǎn)基因組培苗進(jìn)行低溫脅迫觀察表型變化,發(fā)現(xiàn)在相同的處理?xiàng)l件下,非轉(zhuǎn)基因植株因不能適應(yīng)低溫的環(huán)境,完全枯死,而部分木薯轉(zhuǎn)AtGolS2、AtGolS2-ipt、CBF3基因株系卻表現(xiàn)出了很強(qiáng)的低溫耐受性,植株項(xiàng)部生長(zhǎng)組織并沒(méi)有被低溫完全迫害,恢復(fù)室溫后又能繼續(xù)生長(zhǎng)。通過(guò)對(duì)盆栽苗進(jìn)行4℃低溫處理及生理指標(biāo)的檢測(cè)發(fā)現(xiàn),部分轉(zhuǎn)AtGolS2、AtGolS