南瓜韌皮液mRNA結合蛋白的純化與CmRBP50核糖核蛋白復合體形成的分子機制.pdf

1、植物韌皮部作為植物維管束重要的組成部分，不僅充當著同化碳水化合物的運輸通道，更因其內含激素、活性氧、鈣離子、RNA與蛋白等信息物質而充當著協(xié)調植物系統(tǒng)生長與發(fā)育的信息高速公路。植物維管系統(tǒng)對于植物響應環(huán)境逆境變化也起著舉足輕重的作用，深入了解植物韌皮部長距離信號物質及其作用可提供提高農作物生產率的手段。南瓜因其維管柬分明，容易采集韌皮液而成為研究維管束系統(tǒng)最好的模式植物之一。目前其韌皮液內RNA轉錄組與蛋白質組已獲得，但是我們對其韌皮液

2、內上千RNA與蛋白的研究還只是冰山一角，仍有很多問題尚待研究。本實驗室此前研究發(fā)現(xiàn)了RNA結合蛋白CmRBP50在南瓜韌皮液內形成了一個核糖核蛋白(ribonucleoprotein，RNP)復合體，這是目前為止在植物中獲得的第一個能進行長距離運輸?shù)暮颂呛说鞍讖秃象w，但是關于此復合體的形成機制還不清楚。本文以南瓜(Cucurbita maxima cv Big Max)為材料，通過生物化學、分子生物學等手段研究了南瓜韌皮液內可能的mRN

3、A結合蛋白及基于CmRBP50核糖核蛋白復合體的形成分子機理。取得主要結果如下：
　　 1.運用蛋白質組學手段研究了南瓜韌皮液內可能的mRNA結合蛋白。通過Poly(U)親和柱結合液相串聯(lián)質譜(LC-MS/MS)技術獲得了南瓜韌皮液內29個潛在的mRNA結合蛋白。其功能包括與RNA代謝、翻譯相關，與蛋白代謝、運輸相關，與細胞結構、能量產生相關，與代謝相關及一些功能未知的蛋白。
　　 2.研究了CmRBP50的磷酸化位點及

4、其對于CmRBP50RNP形成的重要性。首先通過蛋白overlay技術明確了磷酸化修飾對基于CmRBP50RNP形成的重要性，然后通過液相串聯(lián)質譜鑒定獲得了四個磷酸化位點絲氨酸223、438、440和444。通過點突變及小西葫蘆黃化花葉病毒(Zucchiniyellow mosaic virus，ZYMV)表達系統(tǒng)表達并純化獲得了CmRBP50及S223A(絲氨酸223突變?yōu)楸彼?，STripleA(絲氨酸438、440、444分別突

5、變?yōu)楸彼?，SQuadA(絲氨酸223、438、440、444分別突變?yōu)楸彼?等點突變蛋白。蛋白overlay與免疫共沉淀技術證實了以上磷酸化位點對于此RNP形成的重要性，尤其是C端Ser438、440和444突變?yōu)楸彼岷罂沙浞謩冸xCmRBP50與其他蛋白間的互作。最后，我們克隆并表達了CmRBP50的潛在互作蛋白，運用體外pull down技術證實CmRBP50與CmPP16，GTPbP及PSPL可發(fā)生體外互作，且其C端的磷酸化

6、修飾對其互作至關重要。
　　 3.研究了可能磷酸化CmRBP50的激酶。通過運用膠內磷酸化(In gel kinaseassay)技術從維管束蛋白與韌皮液蛋白著手，鑒定了可能磷酸化CmRBP50的激酶。通過對可疑位點質譜鑒定我們得到核苷二磷酸激酶，絲/蘇氨酸激酶，蛋白激酶adk1和蛋白激酶Csa000515及糖原合成酶激酶-3等可能的激酶，經論證推測最有可能的是糖原合成激酶-3。
　　 本文通過對韌皮液內mRNA結合蛋白