膽固醇分子和PI3K-Akt及MAPK-ERK1-2信號(hào)通路在牛皰疹病毒1型感染MDBK細(xì)胞中的作用研究.pdf

1、牛皰疹病毒1型(Bovine herpesvirus type1,BoHV-1)是牛傳染性鼻氣管炎病(Infectious bovine rhinotracheitis,IBR)的病原體,該病毒感染主要引起呼吸道,消化道,生殖道,眼結(jié)膜和神經(jīng)等多組織、器官的炎癥;由該病毒感染引起呼吸道上皮細(xì)胞的壞死和免疫抑制導(dǎo)致繼發(fā)曼氏溶血桿菌和睡眠嗜血桿菌感染的發(fā)生而致高死亡率,以及由于生殖道感染而導(dǎo)致的流產(chǎn)對(duì)奶牛養(yǎng)殖業(yè)造成巨大損失。潛伏感染是本病毒

2、重要特點(diǎn),感染后該病毒在神經(jīng)節(jié)和扁桃體內(nèi)潛伏感染使患牛終生帶毒而成為重要傳染源,在應(yīng)激或免疫力下降時(shí)病毒被激活而發(fā)病,該病在世界各地廣泛分布已經(jīng)給養(yǎng)牛業(yè)帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)損失。
　　 病毒感染靶細(xì)胞的過(guò)程中需要一些重要細(xì)胞分子的幫助才能完成復(fù)制周期,同時(shí)病毒與細(xì)胞相互作用的過(guò)程中可能會(huì)激活或抑制細(xì)胞的某些重要的信號(hào)傳導(dǎo)通路,因此開(kāi)展相應(yīng)的基礎(chǔ)研究尋找BoHV-1感染MDBK細(xì)胞的過(guò)程中涉及的關(guān)鍵分子和信號(hào)通路,對(duì)于揭示病毒與細(xì)胞相互作

3、用的關(guān)系,從而解析該病毒的感染機(jī)理,甚至對(duì)于新藥物的研發(fā)設(shè)計(jì)都具有重要意義。
　　 Lipid rafts是大量分布于細(xì)胞膜上具有多種生物學(xué)功能的特定結(jié)構(gòu),主要由膽固醇、糖苷鞘磷脂、鞘磷脂和磷脂等成分緊密結(jié)合有序排列而構(gòu)成;該結(jié)構(gòu)穩(wěn)定存在于脂質(zhì)雙層細(xì)胞膜上,主要參與跨膜運(yùn)輸、胞吞和胞吐過(guò)程中蛋白質(zhì)的分選,細(xì)胞粘附和遷移,細(xì)胞凋亡,突觸傳遞,細(xì)胞骨架的組織等多種生物學(xué)功能。最近研究發(fā)現(xiàn)Lipid rafts與多種病原微生物的感染有

4、關(guān),而膽固醇作為該結(jié)構(gòu)的重要成分是否參與了BoHV-1感染MDBK細(xì)胞的過(guò)程值得探索并深入研究。
　　 膽固醇分子是Lipid rafts的主要成分,通過(guò)研究膽固醇可以錨定研究Lipidrafts的功能,Methyl-β-cyclodextrin(MβCD)能夠有效去除細(xì)胞膽固醇分子,可以用于Lipid rafts功能研究。本研究發(fā)現(xiàn)采用MβCD處理MDBK細(xì)胞可以有效的降低細(xì)胞膽固醇含量,同時(shí)能夠顯著抑制病毒的復(fù)制,且該抑制作

5、用具有劑量依賴性,MβCD處理的MDBK細(xì)胞經(jīng)外源水溶性膽固醇分子恢復(fù)處理后,可以部分回復(fù)病毒的復(fù)制功能,使病毒滴度增加,這表明細(xì)胞膽固醇分子的部分去除是造成該病毒滴度下降主要原因,進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)在病毒感染侵入后的階段去除膽固醇分子對(duì)病毒的滴度影響不顯著,膽固醇分子的去除并不影響病毒與MDBK細(xì)胞的結(jié)合。從病毒方面因素來(lái)考慮,采用MβCD處理病毒而降低囊膜膽固醇分子的含量也能導(dǎo)致病毒感染力下降,當(dāng)補(bǔ)加外源性膽固醇分子時(shí)該抑制效應(yīng)可以被部

6、分抵消,可見(jiàn)膽固醇分子對(duì)于病毒的感染力具有重要作用。綜上研究結(jié)果表明細(xì)胞膜膽固醇分子對(duì)于BoHV-1侵入靶細(xì)胞具有重要作用,而病毒囊膜膽固醇分子對(duì)于該病毒的感染力具有重要意義,這為深入研究該病毒致病機(jī)理打下基礎(chǔ)。由于Lipid rafts內(nèi)含有多種分子參與了細(xì)胞相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo),我們推測(cè)膽固醇分子的去除,破壞了一些信號(hào)分子發(fā)揮作用的環(huán)境,導(dǎo)致病毒侵入的某些環(huán)節(jié)被阻斷,鑒于目前BoHV-1感染的過(guò)程中激活了那些信號(hào)通路尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道,所以該推

7、論需要研究證實(shí)。
　　 Phosphatidylinositol3-kinases/Akt(P13K/Akt),信號(hào)通路是執(zhí)行多種生物學(xué)功能的信號(hào)調(diào)控系統(tǒng),即在P13K的調(diào)節(jié)下Akt通過(guò)調(diào)節(jié)多種蛋白分子的活性來(lái)執(zhí)行P13K調(diào)控的多種生理學(xué)反應(yīng),如細(xì)胞存活和細(xì)胞增殖,血管生成,代謝調(diào)控和細(xì)胞遷移等。絲裂原激活的蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)超家族能夠?qū)⒔邮艿亩喾N刺激信號(hào)跨膜傳

8、遞到細(xì)胞核執(zhí)行相應(yīng)的生物學(xué)功能,細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1和2(Extracellular signal-regulated kinases1 and2,Erk1/2)作為MAPK超家族的成員參與調(diào)節(jié)多種細(xì)胞生物學(xué)功能如細(xì)胞增殖、細(xì)胞轉(zhuǎn)化、細(xì)胞分化、細(xì)胞存活和死亡等過(guò)程。BoHV-1感染MDBK細(xì)胞的過(guò)程中是否需要該P(yáng)13K/Akt和MAPK/Erk1/2信號(hào)通路的參與尚不清楚。
　　 本研究發(fā)現(xiàn)BoHV-1感染MDBK細(xì)胞的過(guò)程中能

9、夠激活A(yù)kt和Erk1/2,包括感染的早期短暫激活和晚期持續(xù)性激活,且經(jīng)紫外線滅活的病毒仍然能夠在感染的早期激活A(yù)kt和Erk1/2而不能在晚期激活A(yù)kt和Erk1/2,表明病毒與細(xì)胞結(jié)合和/或侵入的過(guò)程中能夠激活A(yù)kt和Erk1/2,后期Akt和Erk1/2的持續(xù)性激活與病毒基因表達(dá)的過(guò)程有關(guān);病毒誘導(dǎo)的Akt激活可以被P13K抑制劑Ly294002特異性阻斷,病毒誘導(dǎo)的Erk1/2激活可以被MAPK激酶(MAPK kinase,ME

10、K1/2)的抑制劑U0126所抑制,這表明Akt和Erk1/2的上游激活子分別是P13K和MEK1/2。此外用Akt的抑制劑Ly294002處理MDBK細(xì)胞導(dǎo)致病毒滴度下降1.5log,表明P13K的激活對(duì)于病毒的復(fù)制具有重要意義,而MEK1/2的抑制劑處理細(xì)胞后病毒滴度無(wú)明顯變化,表明抑制MAPK/Erk1/2信號(hào)通路不影響病毒的復(fù)制;進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)P13K的激活對(duì)于該病毒的復(fù)制周期中侵入后階段影響顯著,盡管病毒與細(xì)胞結(jié)合即可激活該P(yáng)

11、13K/Akt信號(hào)通路,但是抑制P13K的活性并不影響病毒與細(xì)胞的結(jié)合,同樣在侵入階段抑制P13K的活性對(duì)于該病毒的復(fù)制影響不顯著;本研究首次闡明在BoHV-1感染MDBK細(xì)胞的過(guò)程中能夠激活P13K/Akt和MAPK/Erk1/2兩個(gè)信號(hào)通路,特別是P13K的激活對(duì)于病毒復(fù)制周期的侵入后階段具有重要意義。
　　 Lipid rafts形成一個(gè)疏水性微環(huán)境,可能是多種分子相互作用的位點(diǎn)和場(chǎng)所,我們前期的研究發(fā)現(xiàn)膽固醇分子參與Bo

12、HV-1感染MDBK細(xì)胞的侵入過(guò)程,而在該病毒侵入和/或結(jié)合靶細(xì)胞的過(guò)程中又能激活P13K/Akt和MAPK/Erk1/2兩個(gè)信號(hào)通路,但是該信號(hào)通路的早期激活過(guò)程是否受膽固醇分子的影響并不清楚,本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)降低細(xì)胞表面膽固醇含量對(duì)該病毒誘導(dǎo)的P13K/Akt和MAPK/Erk1/2早期激活影響不顯著。
　　 本研究首次闡明在BoHV-1感染MDBK細(xì)胞的過(guò)程中需要細(xì)胞膽固醇分子的參與才能有效的完成侵入過(guò)程,在感染的早期和晚期都能