勃利霉素與靶酶ThrRS的作用位點及其抑制劑的虛擬篩選.pdf

1、大豆疫霉（Phytophthora sojae，簡寫P.sojae）屬卵菌綱真菌，是存在于土壤當中的植物病原菌，能夠引起大豆植株莖和根的腐爛，該病是大多數(shù)大豆種植區(qū)都比較普遍的疾病之一，會引起大豆大量減產(chǎn)。為了鑒定勃利霉素與PsThrRS的結(jié)合位點，以便通過虛擬篩選技術(shù)發(fā)現(xiàn)更多對PsThrRS選擇性更高、活性更好的先導化合物，從而防治大豆疫霉引起的各種疾病，本研究首先利用分子對接技術(shù)和定點突變技術(shù)相結(jié)合的方法研究了勃利霉素與大腸桿菌蘇氨

2、酰tRNA合成酶(EThrRS)的結(jié)合位點;接著利用同源建模首次建立了PsThrRS的三維結(jié)構(gòu);鑒于分子對接預(yù)測勃利霉素與EThrRS結(jié)合位點的準確性，再次利用分子對接預(yù)測了勃利霉素與PsThrRS的結(jié)合位點。為了發(fā)現(xiàn)勃利霉素與PsThrRS結(jié)合更為重要的氨基酸殘基，對PsThrRS涉及勃利霉素結(jié)合的每一個氨基酸殘基都進行了虛擬點突變，并通過分子對接比較了突變后勃利霉素與PsThrRS突變體結(jié)合自由能的變化。最后，為了得到PsThrRS

3、抑制劑的候選化合物，分別進行了基于分子對接和基于藥效團模型兩種方法的虛擬篩選。得到的結(jié)果如下:
　　1)勃利霉素與EThrRS的結(jié)合位點的研究
　　首先分別從PDB的網(wǎng)站上和NCBI化合物數(shù)據(jù)庫中獲取了EThrRS和勃利霉素的三維結(jié)構(gòu)的文件，然后利用計算機分子對接技術(shù)通過AutoDock Vina軟件將勃利霉素與EThrRS的活性中心進行對接。結(jié)果表明，所有與勃利霉素結(jié)合相關(guān)的氨基酸殘基都處在與活性中心相鄰的外側(cè)，它們由氨基

4、酸殘基Y313、R363、R375、P424、E458、G459和K465組成。值得注意的是，勃利霉素的結(jié)合自由能(-9.1kcal/mol)高于ATP的結(jié)合自由能(-9.6kcal/mol)，說明ATP的結(jié)合比勃利霉素更加容易。這表明ATP先于勃利霉素與EThrRS結(jié)合，且ATP處在比勃利霉素更加深入的EThrRS的活性中心。所以，我們推測勃利霉素并不阻止ATP和蘇氨酸與ThrRS的結(jié)合，而是通過誘導口袋關(guān)閉阻止Thr-AMP和PPi

5、的釋放。為了找到與勃利霉素結(jié)合更加重要的氨基酸殘基，通過將EThrRS的蛋白序列與分別來自勃利霉素敏感(S.solfataricus和P.sojae)和勃利霉素抗性物種（M.jannaschii和A.fulgidus）的ThrRS的蛋白序列進行多序列比對。結(jié)果表明Y313、P424、E458、G459可能對勃利霉素的結(jié)合更加重要，這些殘基的任何改變都可能影響ThrRS對勃利霉素的敏感性。為了驗證計算機預(yù)測結(jié)果的準確性，通過定點突變技術(shù)被

6、分別構(gòu)建ThrRS突變體P424K、E458△和G459△(Y313已被報道涉及勃利霉素的結(jié)合)。然后，通過高效液相色譜(HPLC)測定它們的酶動力學參數(shù)（如kcat和Km）進而比較它們與野生型EThrRS的酶活差異。之后，由酶抑制試驗測得Ki值，以比較野生型EThrRS與突變體對勃利霉素親和力的差異。并通過圓二色光譜比較了野生型EThrRS與突變體的結(jié)構(gòu)。最后，運用熒光停留比較了野生型EThrRS與突變體表觀速率常數(shù)(Kapp)的差異

7、。圓二色光譜的結(jié)果表明突變體P424K、E458△、G459△的二級結(jié)構(gòu)較野生型ThrRS并未發(fā)生變化。酶活實驗表明，突變體的酶活性與野生型EThrRS相比差異并不顯著，然而，它們與勃利霉素的親和力和表觀速率常數(shù)均有下降。這說明Y313、P424、E458、G459確實對勃利霉素結(jié)合EThrRS具有更為重要的作用。
　　2) PsThrRS三維結(jié)構(gòu)的研究
　　首先比較了PsThrRS與PDB中現(xiàn)有ThrRS的蛋白序列，比對結(jié)

8、果表明PsThrRS的氨基酸殘基1-76與95-152分別和人類ThrRS(PDB ID:4HWT)的氨基酸殘基371-445及462-525同源性較高，而PsThrRS的氨基酸殘基72-110與147-744分別和EThrRS(PDB ID:1QF6)的氨基酸殘基4-41及42-642同源性較高。所以，人類ThrRS和EThrRS的對應(yīng)三維結(jié)構(gòu)被用作模板。利用同源建模的方法，通過Modeller9.10軟件，使用“非?？焖賱恿W優(yōu)化”

9、參數(shù)構(gòu)建了1000個PsThrRS的三維結(jié)構(gòu)。接著，利用Modeller9.10軟件自帶的評估程序從這1000模型中選取了最好的10個，然后通過MolProbity3.15程序評估這10個模型，從而綜合選出1個最優(yōu)模型。由于模型393包含的鍵角、鍵長、原子重疊和phi/psi角的錯誤最少，該模型被選為最優(yōu)模型。模型393的拉曼圖顯示95.96％(711/742)的氨基酸殘基都處在合適的區(qū)域，99.7％(740/742)的氨基酸殘基處在可

10、接受區(qū)域。模型393中僅有2個氨基酸殘基處在不可接受區(qū)域。這些結(jié)果說明構(gòu)建的模型393是比較可靠的。為了發(fā)現(xiàn)PsThrRS潛在的結(jié)合位點，利用gromacs5.0對模型393進行了20ns的分子動力學模擬，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PsThrRS未含有更多的勃利霉素結(jié)合位點，說明勃利霉素與PsThrRS的結(jié)合位點很可能與EThrRS對應(yīng)相似。
　　3)勃利霉素與PsThrRS的結(jié)合位點的研究
　　首先通過計算機分子對接技術(shù)利用AutoDock

11、 Vina軟件將勃利霉素與PsThrRS的活性中心進行對接。接著通過Discovery Studio Viewer3.5查找得到勃利霉素周圍5(A)以內(nèi)的所有氨基酸殘基作為候選殘基。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在PsThrRS上距勃利霉素5(A)以內(nèi)的氨基酸殘基有His-412、Tyr-416、Met-435、Cys-437、Arg-466、Arg-478、Gln-484、Asp-486、Ala-564、 Tyr-566、 Lys-569、Gln-583、

12、Thr-586、Gln-588和His-616。然后，通過同源建模，利用Modeller9.10軟件將上述所有的候選殘基分別虛擬點突變?yōu)榕c原來氨基酸不同的其它19個氨基酸，并利用AutoDock Vina軟件分別與勃利霉素進行分子對接，計算每個點突變后的最大結(jié)合自由能、最小結(jié)合自由能，以確定每個點突變后可以波動的范圍。波動范圍越大，該殘基越重要。分子對接的結(jié)果表明，勃利霉素與PsThrRS的結(jié)合位點和EThrRS上的結(jié)合位點相似，也位于

13、鄰近PsThrRS活性位點的外側(cè)，所以作用機制也應(yīng)該相同。氨基酸序列比對、虛擬點突變和分子對接預(yù)測表明，其中Tyr-416、Met-435、Cys-437、Arg-466、Gln-484、Asp-486、Gln-583、Thr-586、Gln-588、His-616、Ala-618對接得分的波動值均不小于1.5kcal/mol，說明這些氨基酸殘基對勃利霉素與PsThrRS結(jié)合更為重要。
　　4)基于PsThrRS三維結(jié)構(gòu)的虛擬篩選

14、
　　基于與勃利霉素至少50％結(jié)構(gòu)類似的標準進行篩選，從ZINC數(shù)據(jù)庫的3500多萬小分子中篩選出來2141個勃利霉素衍生物。然后，通過將這些化合物分別與P.sojae ThrRS進行分子對接，得到結(jié)合自由能低于勃利霉素的小分子23個。為了明確化合物結(jié)構(gòu)與結(jié)合自由能的關(guān)系，將2141個小分子化合物按照與PsThrRS結(jié)合自由能的大小進行排序，從中隨機選取結(jié)合自由能不同的化合物各一個，共32個化合物，通過Discovery Stud

15、io3.5建立藥效團模型。由于Hypo1具有最高的消耗差異(116.338)、最佳的相關(guān)系數(shù)(0.992)和最低的根均方差(0.325807)，將其確定為最佳模型。這也表明Hypo1具有較好的預(yù)測能力。利用模型Hypo1再次篩選上述的2141個小分子化合物，先前的23個高親和力化合物再次被篩選出來，但所用篩選時間僅大約為35 min，約為先前相同計算機配置上利用AutoDock Vina篩選所耗時間（約60 h）的1/100。說明利用藥

16、效團模型篩選藥物庫的速度要遠高于分子對接的速度。于是利用Hypo1對Drugbank全數(shù)據(jù)庫（共計6858個小分子）進行了虛擬篩選，得到匹配結(jié)果10個。再次利用AutoDock Vina對這10個配體分別進行對接驗證，發(fā)現(xiàn)其中6個配體的結(jié)合能小于勃利霉素，且與之前的23個化合物結(jié)構(gòu)并不相同。由此可知，利用藥效團模型Hypo1對Drugbank全數(shù)據(jù)庫篩選得到的PsThrRS抑制劑的準確率大約為60％(6/10)。我們從6858個小分子中

17、篩選PsThrRS的抑制劑，得到的抑制劑數(shù)量卻不如從2141個勃利霉素結(jié)構(gòu)類似物篩選得到的數(shù)量多。這說明利用勃利霉素為先導化合物搜索ZINC中的勃利霉素結(jié)構(gòu)類似物的確起到了PsThrRS抑制劑的初步富集作用，說明勃利霉素能夠較好的抑制PsThrRS，與其特異的結(jié)構(gòu)有關(guān)。
　　綜上所述，本研究利用生物信息學和分子生物學相結(jié)合的方法探索了勃利霉素與EThrRS的結(jié)合位點;通過同源建模的方法首次建立了PsThrRS的三維結(jié)構(gòu);利用分子動