家蠶先天免疫的模式識(shí)別、信號(hào)傳導(dǎo)和抗微生物肽基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、家蠶是由野蠶馴化而來(lái)的泌絲昆蟲(chóng)，具有很高經(jīng)濟(jì)價(jià)值，然而我國(guó)每年卻因蠶病造成近百億左右的損失，嚴(yán)重影響到產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。研究表明，當(dāng)微生物感染昆蟲(chóng)時(shí)，能誘導(dǎo)其產(chǎn)生不同的抗微生物肽以殺死入侵微生物。而這些抗微生物肽基因的表達(dá)主要通過(guò)Toll和Imd(immunedeficiency)信號(hào)途徑調(diào)控。我們通過(guò)對(duì)家蠶免疫相關(guān)基因中的短型肽聚糖識(shí)別蛋白3(BmPGRP-S3)和β-葡聚糖識(shí)別蛋白3、4(BmβGRP3、4)及Toll、Imd途徑關(guān)

2、鍵基因BmSpz1和BmImd的研究，初步探索家蠶體液免疫的模式識(shí)別、信號(hào)傳導(dǎo)和抗微生物肽基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制。獲得主要結(jié)果如下：
　　 1.模式識(shí)別受體編碼基因的克隆及表達(dá)譜分析
　　 模式識(shí)別受體在體液免疫-Toll和Imd途徑中行使模式識(shí)別功能，并調(diào)控激活下游信號(hào)因子和抗微生物肽基因的表達(dá)。我們對(duì)家蠶模式識(shí)別受體-肽聚糖識(shí)別蛋白(PGRPs)和β-葡聚糖識(shí)別蛋白(βGRPs)家族基因進(jìn)行研究，克隆得到10個(gè)PGRPs和

3、4個(gè)βGRPs，得到BmβGRP3、BmPGRP-S3、-S4和BmPGRP-L5的完整編碼序列。βGRPs家族成員都具有信號(hào)肽，其中BmβGRP1-3成簇分布于11號(hào)染色體，且不具有典型的葡聚糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域，BmβGRP4獨(dú)立分布于22號(hào)染色體，具有典型的葡聚糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域。PGRPs的長(zhǎng)型和短型亞家族都具有典型的酰胺酶活性(amidaseactivity)結(jié)構(gòu)域，短型亞家族具有信號(hào)肽，長(zhǎng)型亞家族則不具有。5個(gè)長(zhǎng)型亞家族基因成簇分布于1號(hào)

4、染色體，5個(gè)短型亞家族基因中有2個(gè)分布于9號(hào)染色體和3個(gè)分布于16號(hào)染色體。人工飼料無(wú)菌飼育的大造品系5齡3天幼蟲(chóng)添食大腸桿菌(E.coli，Ec)、家蠶黑胸?cái)⊙?B.bombysepticus，Bs)和家蠶白僵菌(B.bassiana，Bb)，免疫誘導(dǎo)3、6、12和24h四個(gè)時(shí)間點(diǎn)的個(gè)體水平熒光定量PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)PGRPs長(zhǎng)型亞家族基因BmPGRP-L1、-L3和短型亞家族基因BmPGRP-S1-3均能被革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽(yáng)性菌

5、和真菌誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)；βGRPs基因家族中的BmβGRP3、4也能被上述三種微生物誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)。組織表達(dá)譜分析表明，所檢測(cè)的13個(gè)識(shí)別受體基因，在頭部組織中，BmβGRP2，4、BmPGRP-L2和BmPGRP-S1，-S3-5均能被陰性菌、陽(yáng)性菌和真菌誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)；在表皮、中腸和脂肪體中，只有少數(shù)識(shí)別受體基因被三類(lèi)微生物誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)。
　　 2.BmβGRP3功能研究
　　 果蠅(Drosophila)基因組中有編碼3個(gè)

6、陰性菌結(jié)合蛋白的基因，其中GNBP1由Lys-PGN激活，GNBP3由真菌激活，GNBP1和GNBP3均在Toll信號(hào)途徑上游起模式識(shí)別功能并調(diào)控該信號(hào)通路。家蠶BmβGRP1、2被證實(shí)具有結(jié)合β-1，3-葡聚糖的能力且激活家蠶細(xì)胞免疫應(yīng)答，但并未發(fā)現(xiàn)它們具有在家蠶Toll或Imd信號(hào)途徑上游行使模式識(shí)別的功能。
　　 BmβGRP3的開(kāi)放式閱讀框(openreadingframe，ORF)為1470bp，編碼489個(gè)氨基酸，N

7、-端有一個(gè)由17個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽，推測(cè)可能為分泌型蛋白，48和454位處的天冬氨酸是潛在的糖基化位點(diǎn)，蛋白分子量為53kDa，等電點(diǎn)6.25。BmβGRP3的氨基酸序列高度保留了結(jié)合β-1，3-葡聚糖的功能結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域能結(jié)合三重螺旋結(jié)構(gòu)的β-1，3-葡聚糖。家蠶BmβGRP3在個(gè)體水平能被革蘭氏陰性菌、陽(yáng)性菌和真菌誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，其中在個(gè)體水平陽(yáng)性菌和真菌誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)能力強(qiáng)于陰性菌。組織水平上，在表皮中能被真菌高量誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，陽(yáng)

8、性菌對(duì)該基因基本無(wú)誘導(dǎo)表達(dá)能力；在脂肪體中能被陰性菌高量誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，陽(yáng)性菌和真菌誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)該基因的能力較弱；在中腸組織中，該基因能被陰性菌和陽(yáng)性菌較明顯地誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，真菌對(duì)該基因基本無(wú)誘導(dǎo)表達(dá)能力，表明家蠶BmβGRP3在應(yīng)對(duì)不同微生物誘導(dǎo)時(shí)有著不同的表達(dá)模式和組織特異性。RNA干涉抑制BmβGRP3表達(dá)相關(guān)研究表明其在家蠶Toll信號(hào)途徑上游行使模式識(shí)別功能和激活調(diào)控該途徑的作用；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)BmβGRP3的抑制表達(dá)會(huì)降低To

9、ll信號(hào)途徑的信號(hào)因子BmSpz1等基因的表達(dá)和抗微生物肽基因BmCecropin-A1、BmCecropin-E、BmAtt2和BmEnb1的表達(dá)，表明Toll信號(hào)途徑可能調(diào)控抗微生物肽基因BmCecropin-A1、BmCecropin-E、BmAtt2和BmEnbl的表達(dá)。另一方面，家蠶BmβGRP3的抑制表達(dá)不會(huì)影響到Imd信號(hào)途徑信號(hào)因子BmImd和抗微生物肽基因BmCecropin-B、BmCecropin-D和glover

10、in2的表達(dá)，暗示其它免疫調(diào)控途徑如Imd信號(hào)途徑可能調(diào)控抗微生物肽基因BmCecropin-B、BmCecropin-D和gloverin2表達(dá)。
　　 對(duì)家蠶Toll和Imd信號(hào)途徑免疫因子BmSpz1、BmImd等基因的誘導(dǎo)表達(dá)分析結(jié)果表明三類(lèi)微生物(革蘭氏陰性菌、陽(yáng)性菌和真菌)都能激活家蠶的Toll和Imd信號(hào)途徑，這與模式生物果蠅的Toll和Imd信號(hào)途徑有很大的不同。果蠅的Toll信號(hào)途徑只能被擁有DAP-型肽聚糖的

11、細(xì)菌和真菌免疫激活，其Imd信號(hào)途徑能被革蘭氏陰性菌和部分陽(yáng)性菌免疫激活。推測(cè)家蠶在其長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中獲得了更有效的免疫應(yīng)答機(jī)制。
　　 3.BmβGRP4和BmPGRP-S3的原核表達(dá)和功能研究
　　 本研究已初步證實(shí)BmβGRP3位于Toll信號(hào)途徑上游并可能調(diào)控抗微生物肽基因BmCecropin-A1、BmCecropin-E、BmAtt2和BmEnb1的表達(dá)。然而關(guān)于Imd信號(hào)途徑的免疫激活和抗微生物肽的表達(dá)調(diào)控

12、仍有待進(jìn)一步研究。
　　 我們期望通過(guò)對(duì)BmβGRP4和BmPGRP-S3進(jìn)行研究，以闡明模式識(shí)別受體在家蠶體液免疫應(yīng)答中的具體生物學(xué)功能。構(gòu)建了BmβGRP4和BmPGRP-S3的原核表達(dá)載體，純化得到BmBGRP4和BmPGRP-S3蛋白，并制備了多克隆抗體。革蘭氏陰性菌、陽(yáng)性菌和真菌免疫誘導(dǎo)18h，BmβGRP4和BmPGRP-S3的mRNA表達(dá)量和蛋白量都顯著提高。該處理方式提高了Toll信號(hào)途徑調(diào)控抗微生物肽基因BmE

13、nb1的表達(dá)，暗示家蠶Toll和Imd信號(hào)途徑可能各自獨(dú)立地調(diào)控抗微生物肽基因的表達(dá)。
　　 4.BmSpz1和BmImd的功能研究
　　 通過(guò)對(duì)家蠶模式識(shí)別受體-BmβGRP3、BmβGRP4和BmPGRP-S3的研究，初步證明了它們?cè)诩倚Q先天免疫應(yīng)答反應(yīng)中的功能。為了進(jìn)一步驗(yàn)證家蠶Toll和Imd信號(hào)途徑所調(diào)控的抗微生物肽基因，我們又分別對(duì)家蠶Toll和Imd信號(hào)途徑的關(guān)鍵基因BmSpz1和BmImd進(jìn)行研究，希望藉

14、此揭示家蠶Toll和Imd信號(hào)途徑免疫信號(hào)的傳導(dǎo)機(jī)制和抗微生物肽基因的表達(dá)調(diào)控模式。
　　 通過(guò)對(duì)BmSpz1和BmImd研究再次證實(shí)了家蠶Toll和Imd信號(hào)途徑均能被三類(lèi)微生物(革蘭氏陰性菌、陽(yáng)性菌和真菌)誘導(dǎo)激活；Toll信號(hào)途徑可能調(diào)控抗微生物肽基因BmCecropin-A1、BmCecropin-E、BmAtt2和BmEnb1的表達(dá)；Imd信號(hào)途徑可能調(diào)控家蠶抗微生物肽基因BmCecropin-B、BmCecropin

15、-D、BmMoricin和Bmgloverin1、2的表達(dá)。
　　 5.家蠶抗微生物肽基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制
　　 昆蟲(chóng)抗微生物肽是昆蟲(chóng)在抵抗微生物侵染過(guò)程中合成的一類(lèi)小分子多肽，在昆蟲(chóng)先天免疫中起重要作用。家蠶基因組中含有比其它昆蟲(chóng)基因組更多的抗微生物肽基因，它們大多數(shù)以多基因家族的形式存在，具有協(xié)同表達(dá)特點(diǎn)。另外家蠶的抗微生物肽基因還含有多個(gè)CAATW元件，可能對(duì)基因轉(zhuǎn)錄的起始頻率起調(diào)節(jié)作用，同時(shí)家蠶抗微生物肽還具有很高的

16、可誘導(dǎo)性和較好的抗微生物活性。到目前為止，我們?nèi)圆磺宄倚Q抗微生物肽基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制，通過(guò)本文的研究，我們提出了一個(gè)可能的家蠶抗微生物肽基因表達(dá)調(diào)控模式。
　　 綜上所述，首先，Toll信號(hào)途徑由其上游的模式識(shí)別受體BmβGRP3完成對(duì)入侵微生物的識(shí)別并順序激活該途徑的信號(hào)因子，如胞外的BmSpz1、跨膜的Toll受體和胞內(nèi)的BmMyd88、BmTube等，致使BmRel由核外進(jìn)入核內(nèi)，結(jié)合家蠶抗微生物肽基因的表達(dá)調(diào)控區(qū)域(κ

17、B-like和GATA元件等)，從而完成對(duì)家蠶抗微生物肽基因BmCecropin-A1、BmCecropin-E、BmAtt2和BmEnb1的表達(dá)調(diào)控。其次，Imd信號(hào)途徑由其上游的模式識(shí)別受體BmβGRP4和BmPGRP-S3完成對(duì)入侵微生物的識(shí)別并順序激活該途徑的信號(hào)因子，致使BmRelish由核外進(jìn)入核內(nèi)，結(jié)合家蠶抗微生物肽基因的表達(dá)調(diào)控區(qū)域(κB-like和GATA元件等)，從而完成對(duì)家蠶抗微生物肽基因BmCecropin-B、