利用RNAi技術(shù)抗棉蚜的研究.pdf

1、RNAi作用是細胞內(nèi)的雙鏈RNA（dsRNA）在Dicer酶的作用下形成~22bp大小的小干擾RNA（siRNA），siRNA在Ago蛋白的作用下組裝到RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物（RISC）中，從而對靶標mRNA進行切割消化從而抑制其表達翻譯。這種基于序列特異性dsRNA對特定基因的沉默作用自其發(fā)現(xiàn)就具有用來對昆蟲的基因進行下調(diào)而達到抗蟲并使害蟲致死的潛能。在傳統(tǒng)的抗蚜方法一切弊病日顯嚴重的情況下，迫切需要尋找新的抗蟲策略。而利用RNAi方

2、法抗蟲可以有效抵抗蟲害，并且安全，而且昆蟲進化不易產(chǎn)生對其抗性，這些優(yōu)點使得RNAi方法成為新的抗蟲策略的首選。
　　 Mao等人在煙草和擬南芥中表達了靶向棉鈴蟲細胞色素P450基因CYP6AE14的dsRNA，當棉鈴蟲進食轉(zhuǎn)基因植物后，體內(nèi)該基因的表達量明顯發(fā)生下降，表明發(fā)生dsRNA對棉鈴蟲體內(nèi)該基因發(fā)生沉默作用。Baum的研究中發(fā)現(xiàn)靶向V型ATP酶A基因(V-ATPase A)的dsRNA可以有效地對內(nèi)源性的mRNA產(chǎn)生沉

3、默作用。
　　 在利用RNAi進行抗蚜蟲研究時，一方面需要選擇效率高的靶標dsRNA，另一方面需要產(chǎn)生高通量的dsRNA，此外還要保證轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生的dsRNA可以在昆蟲進食時運輸?shù)嚼ハx體內(nèi)并發(fā)揮RNAi作用。因此本研究中選擇了的靶標dsRNA基因有V-ATPase A，組織蛋白酶基因Cathepin B，核糖體蛋白Ribosomal protein L18，vesicle-fusing ATPase（小囊泡融合ATPase基因

4、）。另外，由于蚜蟲在進食植物時，以口器吸食植物韌皮部營養(yǎng)成分，為刺吸式進食，因此研究中選擇了韌皮部特異性表達的雙向啟動子RolC來表達dsRNA，并且結(jié)合ToMV病毒的外殼蛋白和起始組裝序列（OAS）對病毒RNA的包裹作用，在雙向啟動子的另一端表達了ToMV的CP蛋白基因，以期可以產(chǎn)生對dsRNA一定的包裹作用而在昆蟲進食時運輸?shù)嚼ハx中腸內(nèi)發(fā)揮RNAi作用，并且對于頸環(huán)結(jié)構(gòu)的dsRNA的環(huán)形結(jié)構(gòu)序列結(jié)構(gòu)選擇了ToMV病毒的OAS。

5、>　　 研究中針對所選的基因構(gòu)建5個韌皮部特異性表達的干擾載體，雙向啟動子一端表達dsRNA，另一端表達CP蛋白基因。構(gòu)建成功的干擾載體通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法導(dǎo)入到野生型擬南芥中，對獲得的轉(zhuǎn)基因擬南芥進行PCR鑒定。另外還對轉(zhuǎn)基因擬南芥進行RT-PCR和Northern檢測干擾載體在轉(zhuǎn)基因植物體內(nèi)的RNA表達情況。此外還對轉(zhuǎn)基因擬南芥接種棉蚜，進行抗蚜數(shù)據(jù)統(tǒng)計檢測其抗蚜效價。
　　 實驗中成功構(gòu)建了5個韌皮部特異性表達的干擾載體