枯草芽孢桿菌NCD-2群體感應(yīng)系統(tǒng)comQ基因的克隆和功能分析.pdf

1、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)NCD-2菌株能有效的防治棉花黃萎病,明確其生防作用機(jī)理將有助于提高其生防效果。本研究對(duì)影響B(tài).subtilis NCD-2菌株遺傳轉(zhuǎn)化的因素進(jìn)行摸索并對(duì)其轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行優(yōu)化,建立了該菌株的高效電擊轉(zhuǎn)化體系。通過(guò)比較5個(gè)不同大小和攜帶不同來(lái)源復(fù)制子的質(zhì)粒對(duì)其轉(zhuǎn)化效率的影響,發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒大小與NCD-2菌株的電擊轉(zhuǎn)化效率之間沒(méi)有明確的相關(guān)性；而攜帶來(lái)源于B.coagulans復(fù)制子的質(zhì)粒pNW3

2、3N時(shí),NCD-2菌株的電擊轉(zhuǎn)化效率最高,可以達(dá)到3.6x104cfu·μg-1DNA,說(shuō)明復(fù)制子來(lái)源是影響轉(zhuǎn)化效率的一個(gè)重要因素。采用pNW33N質(zhì)粒在不同電阻、電場(chǎng)強(qiáng)度及培養(yǎng)時(shí)間下的電擊轉(zhuǎn)化效率的研究結(jié)果表明,該菌株轉(zhuǎn)接到生長(zhǎng)培養(yǎng)基后,37℃、150 r·min-1培養(yǎng)3.5h,在電阻值200Ω、電場(chǎng)強(qiáng)度14.0kV·cm-1的條件下轉(zhuǎn)化效率最高,能夠達(dá)到6.1×104cfu·μg-1DNA。優(yōu)化后的轉(zhuǎn)化體系為順利開(kāi)展B.subti

3、lis NCD-2菌株的分子遺傳學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。
　　 細(xì)菌的群體感應(yīng)系統(tǒng)(quorum sensing,QS)是細(xì)菌根據(jù)特定的信號(hào)分子濃度監(jiān)測(cè)環(huán)境變化,并調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)來(lái)適應(yīng)環(huán)境變化的一種現(xiàn)象。在枯草芽孢桿菌中,QS系統(tǒng)調(diào)控細(xì)菌生物膜的形成,抗生素的產(chǎn)成及芽孢的形成等性狀。QS系統(tǒng)包括4個(gè)基因,即comX、comQ、comP和comA,其中ComX為10氨基酸肽,經(jīng)ComQ修飾后分泌到胞外與膜上的組氨酸激酶ComP結(jié)合,

4、ComP自磷酸化并將磷酸轉(zhuǎn)移到ComA,磷酸化的ComA控制感受態(tài)形成等的一系列編碼因子的轉(zhuǎn)錄。
　　 通過(guò)對(duì)B.subtilis NCD-2菌株進(jìn)行全基因組序列分析,從中定位并克隆了OS系統(tǒng)基因comX、comQ、comP和coma。利用同源重組技術(shù)對(duì)B.subtilis NCD-2菌株中的comQ基因進(jìn)行了定位突變,獲得comQ基因缺失突變體菌株M6。
　　 提取B.subtilis NCD-2野生型菌株和突變體

5、菌株M6的脂肽提取物。平板拮抗測(cè)定結(jié)果表明突變體菌株M6的脂肽提取物對(duì)番茄灰霉病菌的抑菌效果顯著降低。將脂肽提取物通過(guò)基質(zhì)輔助激光解析質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)鑒定分析表明:突變體菌株M6較NCD-2野生型菌株脂肽類(lèi)物質(zhì)FengycinB的產(chǎn)生量顯著降低；M6比NCD-2多產(chǎn)生一種脂肽類(lèi)物質(zhì)IturinB。因此,推測(cè)comQ對(duì)FengycinB的產(chǎn)生具有正調(diào)控作用,對(duì)IturinB的產(chǎn)生具有負(fù)調(diào)控作用。質(zhì)譜測(cè)定同時(shí)發(fā)現(xiàn)在NCD-2

6、野生型菌株和突變體菌株M6脂肽提取物中均含有一類(lèi)分子量較大的未知物質(zhì),但其在NCD-2野生型菌株中的濃度顯著高于突變體菌株M6。說(shuō)明comQ基因?qū)τ谶@組物質(zhì)的產(chǎn)生有著重要影響。
　　 對(duì)NCD-2野生型菌株和突變體菌株M6生物膜的形成進(jìn)行了定性檢測(cè)和定量檢測(cè),結(jié)果表明突變體菌株M6的生物膜形成能力明顯下降,推測(cè)群體感應(yīng)系統(tǒng)comQ基因?qū)ι锬さ男纬删哂姓{(diào)控作用。
　　 本研究為深入了解群體感應(yīng)系統(tǒng)在NCD-2菌株生防