羅非魚(yú)分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)和C1抑制因子克隆.pdf

1、羅非魚(yú)(Tilapias)是重要的世界性經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi),具有優(yōu)良的養(yǎng)殖性能,隸屬于麗鯛科(Cichlidae)。由于麗鯛科魚(yú)類(lèi)具有豐富的形態(tài)、行為和生態(tài)多樣性,目前已被視為研究生物進(jìn)化的重要模式魚(yú)類(lèi)。本文針對(duì)羅非魚(yú)遺傳學(xué)與進(jìn)化生物學(xué)研究分子標(biāo)記不夠豐富、養(yǎng)殖過(guò)程中病害開(kāi)始暴發(fā)的實(shí)際情況,開(kāi)展了二種羅非魚(yú)(尼羅羅非魚(yú)和奧利亞羅非魚(yú))的通用性微衛(wèi)星標(biāo)記開(kāi)發(fā)、三種羅非魚(yú)(尼羅羅非魚(yú)、奧利亞羅非魚(yú)和薩羅羅非魚(yú))線(xiàn)粒體基因組全序列測(cè)定,以及免疫功能基因

2、-補(bǔ)體1抑制因子(C1INH)的克隆和表達(dá)分析,旨在為羅非魚(yú)的遺傳學(xué)與進(jìn)化生物學(xué)理論研究提供相關(guān)分析工具,為羅非魚(yú)的養(yǎng)殖生產(chǎn)提供相關(guān)理論基礎(chǔ)。具體研究?jī)?nèi)容如下:
　　1、羅非魚(yú)分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)Ⅰ:三種羅非魚(yú)的粒體DNA全序列測(cè)定
　　麗鯛科魚(yú)類(lèi)在進(jìn)化生物學(xué)和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中扮演著重要的角色。尼羅羅非魚(yú)(Oreochromis niloticus)、奧利亞羅非魚(yú)(Oreochromis aureus)、薩羅羅非魚(yú)(Sarotherod

3、on melanotheron)、莫桑比克羅非魚(yú)(Oreochromis mossambicus)不僅具有廣泛的養(yǎng)殖基礎(chǔ)和養(yǎng)殖前景,表現(xiàn)出優(yōu)良的經(jīng)濟(jì)利用價(jià)值,而且也是研究麗鯛科魚(yú)類(lèi)進(jìn)化生物學(xué)方面的模式生物,具有重要的學(xué)術(shù)研究?jī)r(jià)值。在本研究中,對(duì)尼羅羅非魚(yú)、奧利亞羅非魚(yú)和薩羅羅非魚(yú)三種羅非魚(yú)的線(xiàn)粒體DNA全序列進(jìn)行了測(cè)定,并用線(xiàn)粒體蛋白編碼基因探討了它們?cè)邴愼牽浦械南到y(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn):尼羅羅非魚(yú)、奧利亞羅非魚(yú)與薩羅羅非魚(yú)線(xiàn)粒體DNA的

4、序列長(zhǎng)度分別是16,628bp、16,625bp和16,627bp,它們?cè)诮Y(jié)構(gòu)上與其他麗鯛科魚(yú)類(lèi)線(xiàn)粒體DNA結(jié)構(gòu)一樣,包括13個(gè)蛋白編碼基因、2個(gè)rRNA基因、22個(gè) tRNA基因和1個(gè)結(jié)構(gòu)調(diào)控區(qū)。采用三種不同的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建方法(最大簡(jiǎn)約法、最大似然法和貝葉斯法)進(jìn)行的系統(tǒng)進(jìn)化分析,結(jié)果表明:尼羅羅非魚(yú)與莫桑比克羅非魚(yú)關(guān)系較近,而奧利亞羅非魚(yú)與前兩者的關(guān)系較遠(yuǎn)。本部分為羅非魚(yú)的遺傳學(xué)與進(jìn)化生物學(xué)等方面的研究提供了線(xiàn)粒體DNA分子標(biāo)記。

5、
　　2、羅非魚(yú)分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)Ⅱ:尼羅羅非魚(yú)與奧利亞羅非魚(yú)通用性微衛(wèi)星標(biāo)記開(kāi)發(fā)
　　尼羅羅非魚(yú)、奧利亞羅非魚(yú)及其雜交種是當(dāng)前羅非魚(yú)養(yǎng)殖中的主要對(duì)象,它們的遺傳評(píng)估和種質(zhì)鑒定等需要較為豐富的分子標(biāo)記。國(guó)外對(duì)尼羅羅非魚(yú)的微衛(wèi)星(SSR)分子標(biāo)記進(jìn)行了開(kāi)發(fā),但很少評(píng)估這些標(biāo)記在不同種間羅非魚(yú)的通用性。本文以尼羅羅非魚(yú)DNA為基礎(chǔ)開(kāi)發(fā)SSR標(biāo)記,共挑選了256個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行PCR驗(yàn)證,對(duì)其中的207個(gè)克隆進(jìn)行了測(cè)序,發(fā)現(xiàn)159個(gè)克隆具

6、有微衛(wèi)星重復(fù)序列,共設(shè)計(jì)了96對(duì)羅非魚(yú)微衛(wèi)星引物。以31個(gè)非洲尼羅羅非魚(yú)野生群體和25個(gè)奧利亞羅非魚(yú)野生群體進(jìn)行了擴(kuò)增驗(yàn)證,篩選通用性的SSR標(biāo)記,最終獲得27對(duì)具有較高多態(tài)性的通用性引物。27個(gè)引物在尼羅羅非魚(yú)和奧利亞羅非魚(yú)群體中的平均等位基因數(shù)分別為5.78和5.04;平均觀察雜合度分別為0.6022和0.4199,平均期望雜合度分別為0.7436和0.5928。尼羅羅非魚(yú)群體中偏離哈代-溫柏格平衡的位點(diǎn)有4個(gè)(P<0.05),奧利

7、亞羅非魚(yú)中為7個(gè)。本部分為羅非魚(yú)的種質(zhì)評(píng)估和群體遺傳學(xué)研究積累了微衛(wèi)星分子標(biāo)記。
　　3、尼羅羅非魚(yú)C1INH基因克隆與表達(dá)分析
　　羅非魚(yú)(tilapia)是現(xiàn)在養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)中病害較少的種類(lèi)之一,然而近年來(lái)隨著高密度養(yǎng)殖技術(shù)的發(fā)展,羅非魚(yú)疾病發(fā)生的幾率大大增加。研究人員希望通過(guò)開(kāi)發(fā)羅非魚(yú)用疫苗和對(duì)其免疫系統(tǒng)的研究來(lái)探討羅非魚(yú)的病害問(wèn)題。補(bǔ)體系統(tǒng)(complement system)是免疫系統(tǒng)之一,它由一系列蛋白質(zhì)分子組成,它能

8、參與破壞或清除那些與抗體結(jié)合的抗原,包括與抗體結(jié)合的細(xì)胞。本章對(duì)補(bǔ)體分子之一 C1抑制因子(Complement1 inhibitor，C1INH)基因進(jìn)行了克隆和組織表達(dá)差異分析。
　　利用相近物種的保守區(qū)設(shè)計(jì)引物,擴(kuò)增出尼羅羅非魚(yú)C1INH基因部分序列,然后利用3’RACE和5’RACE技術(shù)擴(kuò)增出全長(zhǎng)序列。通過(guò)擴(kuò)增,尼羅羅非魚(yú)C1INH基因的cDNA全長(zhǎng)為2,128bp,5’UTR長(zhǎng)度為101bp、3’UTR長(zhǎng)度為236bp、