煙草內(nèi)生細(xì)菌Itb57生物學(xué)性狀及其對(duì)黑脛病的控制研究.pdf

1、煙草是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物,煙草黑脛病是世界上各煙草種植區(qū)重要病害之一。在我國(guó)大部分煙草種植區(qū)均有發(fā)生,且在多個(gè)省市發(fā)生危害嚴(yán)重。為了迎合工業(yè)上對(duì)特色品質(zhì)的需求,生產(chǎn)上所種植的煙草品種有許多抗病性程度不高。目前對(duì)黑脛病的控制仍然以化學(xué)藥劑為主,從而導(dǎo)致病原菌抗藥性增強(qiáng)、環(huán)境污染及煙葉重金屬含量超標(biāo)等后果,影響防治效果、生態(tài)安全和人類健康等問(wèn)題的出現(xiàn)。為此,本文以生態(tài)防治為指導(dǎo)思想,從植物微生態(tài)系統(tǒng)角度,研究?jī)?nèi)生細(xì)菌對(duì)煙株根際生態(tài)、植株生理

2、生化和病原菌等方面的綜合作用,并以此來(lái)控制煙草黑脛病害。主要研究結(jié)果如下:
　　 內(nèi)生細(xì)菌對(duì)煙株根際生態(tài)的影響10個(gè)內(nèi)生細(xì)菌菌株在3種方式處理后,煙株吸收利用土壤有機(jī)質(zhì)的程度有一定差別,其中菌株Itb295在浸種+灌根處理后土壤有機(jī)質(zhì)含量最高。菌株Itb225、Itb220和Itb57處理后土壤有機(jī)質(zhì)含量與對(duì)照最接近;多數(shù)菌株在3種處理方式下土壤pH值與對(duì)照處理相比,只是略有變化。其中變化最大的是菌株Itb185在浸種處理后,p

3、H值達(dá)到8.23。相對(duì)偏低的是菌株Itb162的浸種處理和Itb28的浸種+灌根處理;各菌株通過(guò)浸種+灌根處理后,均能使土壤中全鉀的含量降低,且總體來(lái)說(shuō),各菌株處理后有利于降低土壤中全鉀含量。而各菌株對(duì)煙苗利用速效鉀的影響上表現(xiàn)出促進(jìn)或抑制作用,Itb225和Itb28兩個(gè)菌株的3種處理均使得速效鉀含量明顯高于對(duì)照處理:10個(gè)菌株處理后對(duì)土壤全磷含量的影響,除菌株Itb220的浸種處理和Itb80的噴霧灌根處理后全磷含量遠(yuǎn)高于對(duì)照處理外

4、,其余各處理與對(duì)照相比,土壤全磷含量相差不大。而各菌株對(duì)土壤中有效磷的影響較大,變化范圍在2.59-18.36 mg/kg,多數(shù)菌株在某種處理方式后可降低土壤中有效磷含量;
　　 各菌株對(duì)土壤中過(guò)氧化氫酶、脲酶和蔗糖酶這3種與土壤肥力相關(guān)的酶活力影響也沒有明顯一致的趨勢(shì),不同菌株對(duì)酶活力影響各有不同。有的菌株可提高某種酶活性,有的也表現(xiàn)出抑制作用;
　　 對(duì)土壤微生物類群影響方面,菌株Itb57和Itb12經(jīng)過(guò)浸種、浸種

5、十灌根和噴霧灌根這3種方式處理后,土壤中真菌的數(shù)量比其余8個(gè)菌株及對(duì)照處理要低一個(gè)數(shù)量級(jí);菌株Itb57在浸種和浸種+灌根處理后,土壤中細(xì)菌數(shù)量最多,且比對(duì)照處理高一個(gè)數(shù)量級(jí);10個(gè)菌株在3種處理方式下和對(duì)照處理一樣,放線菌數(shù)量均在同一個(gè)數(shù)量級(jí)(對(duì)數(shù)值范圍為5.1-5.8)。從趨勢(shì)上可以看出,與對(duì)照相比,多數(shù)菌株處理后能提高土壤中放線菌數(shù)量;對(duì)于功能菌群的影響,多數(shù)菌株發(fā)酵液處理后有利于土壤中固氮菌的增長(zhǎng)。所有菌株能明顯有利于解磷細(xì)菌繁

6、殖。多數(shù)菌株處理后土壤中解鉀細(xì)菌數(shù)量與對(duì)照處理相比波動(dòng)幅度不大。
　　 內(nèi)生細(xì)菌對(duì)煙株生長(zhǎng)的影響10個(gè)內(nèi)生細(xì)菌菌株發(fā)酵液對(duì)煙草幼苗在地上部鮮重、干重、最大葉長(zhǎng)寬和真葉數(shù)等4個(gè)方面各有不同程度的影響,其中Itb57對(duì)煙苗的促生效果較好,其次是Itb185和Itb295。而菌株Itb162在浸種處理方式下對(duì)煙苗的地上部干重和真葉數(shù)兩個(gè)方面有明顯的不利影響。1O個(gè)內(nèi)生細(xì)菌菌株發(fā)酵液在浸種、浸種+灌根和噴霧灌根3種處理方式下,浸種+灌根

7、處理對(duì)煙苗的促生效應(yīng)較好且相對(duì)穩(wěn)定,而浸種處理下部分菌株有抑制煙苗生長(zhǎng)的作用。
　　 重點(diǎn)研究?jī)?nèi)生細(xì)菌選擇對(duì)10個(gè)菌株進(jìn)行綜合評(píng)價(jià),菌株Itb57對(duì)促進(jìn)土壤礦化及植株對(duì)養(yǎng)分的利用相對(duì)較優(yōu),對(duì)土壤3種酶活性無(wú)明顯影響,可顯著降低土壤中真菌數(shù)量,提高細(xì)菌數(shù)量,尤其能提高固氮、解磷和解鉀3大功能細(xì)菌數(shù)量,且對(duì)煙苗的促生效應(yīng)最好。故將內(nèi)生細(xì)菌Itb57作為重點(diǎn)研究對(duì)象,以煙草黑脛病菌YBX1-4菌株作為測(cè)定拮抗活性的標(biāo)準(zhǔn)病原菌株。菌株I

8、tb57的抗菌作用及代謝產(chǎn)物內(nèi)生細(xì)菌Itb57具有廣譜的拮抗活性,對(duì)供試的煙草赤星病菌等9種植物病原真菌均有一定程度的的拮抗作用。其中對(duì)煙草赤星病菌、番茄早疫病菌的抑菌作用最好,抑菌帶寬分別為9.83 mm和9.50 mm。其次是對(duì)花生黑斑病菌的抑制作用,達(dá)9.33 mm。并且對(duì)煙草上的炭疽病菌、灰霉病菌和白絹病菌也有較好的效果。對(duì)煙草黑脛病菌的拮抗研究表明,對(duì)峙培養(yǎng)后使得病菌菌絲扭曲、分支增多,有的菌絲上形成小瘤狀物,多數(shù)菌絲變成短粗

9、的結(jié)節(jié)。代謝產(chǎn)物試驗(yàn)表明菌株Itb57可以產(chǎn)生纖維素酶,蛋白酶,嗜鐵素,不產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶。菌株Itb57的分類地位結(jié)合菌株菌落性狀、形態(tài)特征和生理生化性狀及16S rDNA序列比對(duì)分析,確定Itb57菌株為枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis。獲得菌株Itb57的16S rDNA片斷序列長(zhǎng)度為1397bp,在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的注冊(cè)登錄號(hào)(Accession No)為GQl53538。菌株Itb57對(duì)煙苗生理生化影響菌株It

10、b57發(fā)酵液原液和離心后的上清液可完全抑制煙草種子萌發(fā),而一定濃度的菌懸液能促進(jìn)種子萌發(fā)和幼芽生長(zhǎng),當(dāng)菌懸液濃度為3×107cfu/ml。時(shí)處理最佳。菌株Itb57還能促進(jìn)煙株根系生長(zhǎng)發(fā)育,提高根系活力。菌懸液處理煙苗后能明顯提高植株與抗性相關(guān)的苯丙氨酸解氨酶、過(guò)氧化物酶和多酚氧化酶的活性,但誘導(dǎo)抗性酶活提高的時(shí)間段及增強(qiáng)比例有一定差別。菌株Itb57的內(nèi)生定殖研究通過(guò)利福平標(biāo)記菌株Itb57,獲得抗Rif200μg/mI。的突變株,突

11、變菌株接種后從煙株體內(nèi)回收菌株的培養(yǎng)性狀和對(duì)黑脛病菌的拮抗能力與Itb57基本相同,證明Itb57為內(nèi)生菌株。研究也發(fā)現(xiàn),用其菌懸液處理植株根部,可在莖葉中分離獲得,表明菌株還能在植株內(nèi)從下到上轉(zhuǎn)移,且菌落計(jì)數(shù)表明菌株Itb57在植株各組織中的含菌量以根部最多,為3.72×104cfu/g FW,莖中次之,為2.14×104cfu/g FW,葉片中最少,為0.15×104cfu/g FW。經(jīng)無(wú)菌培養(yǎng)后的煙苗接種菌株Itb57,通過(guò)掃描電

12、鏡和透射電鏡可觀察到菌株Itb57不僅能在植株根表定殖且能進(jìn)入煙草植株中在皮層細(xì)胞內(nèi)定殖,進(jìn)一步證明了菌株Itb57的內(nèi)生性。
　　 菌株Itb57的生物學(xué)特性及發(fā)酵條件培養(yǎng)基篩選試驗(yàn)表明,以花生粉為原料最有利于菌株Itb57生長(zhǎng)繁殖和產(chǎn)生拮抗物質(zhì)。菌株生長(zhǎng)曲線表明,Ith57在0-12h生長(zhǎng)較為緩慢,數(shù)量增加幅度較小,隨后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,菌體數(shù)量快速增加,到48 h達(dá)到最大數(shù)量,隨后菌株生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期。菌株發(fā)酵條件單因素測(cè)定表

13、明,菌株Itb57生長(zhǎng)和抑制黑脛病菌的拮抗物質(zhì)產(chǎn)生的最適條件是:發(fā)酵溫度為28℃、培養(yǎng)液初始pH值為7.0、發(fā)酵時(shí)間為48h、搖瓶轉(zhuǎn)速180r/min和25 mL/500 mL三角瓶裝液量。正交試驗(yàn)優(yōu)化后的最佳發(fā)酵條件組合是發(fā)酵溫度為28℃、培養(yǎng)液初始pH值為7.0、時(shí)間72 h、搖瓶轉(zhuǎn)速180 r/min和25 mL/500 mL三角瓶裝液量。
　　 菌株Itb57對(duì)黑脛病的防治效果 Itb57發(fā)酵液對(duì)煙草黑脛病的溫室防治效果