甘藍(lán)型油菜轉(zhuǎn)基因體系的建立與PWY86及TLW10表達(dá)載體的遺傳轉(zhuǎn)化.pdf

1、油菜是世界四大油料作物之一,在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中以及工業(yè)用途上占重要地位。甘藍(lán)型油菜是三種油菜中籽粒產(chǎn)量最高的種類,是目前油菜生產(chǎn)上栽培的主要品種。一些傳統(tǒng)的雜交育種方法已經(jīng)不能滿足培育抗/耐病蟲害、抗雜草以及改善品質(zhì)的需要,轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展給我們提供了一個(gè)新途徑。目前導(dǎo)入外源基因的方法主要是農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化法。在甘藍(lán)型油菜的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中,農(nóng)桿菌的菌株,外植體的選擇,侵染的濃度,培養(yǎng)基中激素的配比以及抗生素的篩選壓力都會(huì)影響轉(zhuǎn)基因植株的獲得。本實(shí)驗(yàn)通

2、過對(duì)這些影響因素做對(duì)比實(shí)驗(yàn),選擇出適宜的條件及濃度,優(yōu)化了農(nóng)桿菌的再生轉(zhuǎn)化體系。另外將PWY86以及構(gòu)建的TLW10載體采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法分別轉(zhuǎn)化甘藍(lán)型油菜‘中油821’,并對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行了分子鑒定,從而證明了這個(gè)再生轉(zhuǎn)化體系的可行性。
　　 1、TLW10轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建。
　　 以雙元載體pBI121為基礎(chǔ),將Frt-GFP-Tnos片段插入載體HindⅢ位點(diǎn),并通過PCR和酶切檢測(cè),成功的構(gòu)建了TLW10轉(zhuǎn)化載體。<

3、br>　　 2、再生體系的建立。
　　 以甘藍(lán)型油菜‘中油821’為實(shí)驗(yàn)材料,以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ),初步建立了再生體系:用農(nóng)桿菌菌株EHA105具有更高的侵染效率;用甘藍(lán)型油菜‘中油821’的帶子葉的子葉柄為受體,并且苗齡為4D時(shí)具有更高的轉(zhuǎn)化率;侵染的農(nóng)桿菌稀釋成OD值為0.1,AS的濃度為15mg/L,2,4-D1 mg/L AgNO3的濃度為5 mg/L,6-B,A與NAA的濃度組合為3mg/L及0.1mg/L;篩選壓力用

4、的草銨磷除草劑為7 mg/L,卡那霉素為13mg/L。
　　 3、PWY86及TLW10載體的遺傳轉(zhuǎn)化及分子檢測(cè)。
　　 以甘藍(lán)型油菜‘中油821’為受體材料,導(dǎo)入載體PWY86及TLW10,將轉(zhuǎn)化得到的陽性植株進(jìn)行分子檢測(cè),實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:(1)轉(zhuǎn)化PWY86載體獲得的陽性植株用PCR和PCR-southern blot雜交實(shí)驗(yàn)檢測(cè),PCR實(shí)驗(yàn)中用設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增Bar基因序列,得到456bp的特異性條帶,這與預(yù)期結(jié)果相符

5、,初步表明PWY86載體成功轉(zhuǎn)入宿主體內(nèi)。PCR-southern blot雜交實(shí)驗(yàn)也得到與FLP序列雜交的特異性條帶,由此表明:用PWY86載體轉(zhuǎn)化甘藍(lán)型油菜‘中油821’獲得抗性植株。(2)將轉(zhuǎn)化TLW10載體獲得的陽性植株進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)和GUS染色,PCR試驗(yàn)中用設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增NPTⅡ基因序列,得到672bp的特異性條帶,與預(yù)期結(jié)果相符,初步表明TLW10載體成功轉(zhuǎn)入材料體內(nèi)。GUS染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)化植株的根、莖、葉和花蕾中都有G