傳染性法氏囊病分子佐劑靶向提呈亞單位疫苗的研制.pdf

1、傳染性法氏囊病(IBD)是由傳染性法氏囊病毒(IBDV)引起的以破壞雞的中樞免疫器官—法氏囊為一種高度接觸性傳染病，主要會導致雞的免疫力下降，進而對一些病原的易感性增強，并導致一些疫苗免疫的失敗。
　　VP2蛋白是IBDV的主要結構蛋白，主要暴露在核衣殼的外面，攜帶了病毒主要的中和性抗原表位，它能誘導宿主產(chǎn)生針對IBDV的中和性抗體，這種抗體能保護易感雞使其免受IBDV的感染。LT是產(chǎn)毒性大腸埃希菌產(chǎn)生一種不耐熱腸毒素，具有很強的

2、免疫原性和黏膜免疫佐劑活性，但是經(jīng)過基因定點突變后的LT不僅沒有毒性而且仍然保持了良好的黏膜佐劑活性。細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4(CTLA-4)是活化T細胞的表面的一種跨膜糖蛋白分子，而CTLA-4胞外區(qū)能與抗原遞呈細胞上的B7配體結合，但不傳遞負調(diào)節(jié)信號。因此，用CTLA-4胞外區(qū)融合抗原免疫動物，不僅能誘導堅強的體液免疫應答，而且能誘導細胞免疫應答。
　　若將IBDV主要免疫保護性抗原VP2、大腸桿菌LT去毒突變體(mLT)

3、及雞CTLA-4胞外區(qū)基因片段融合，構建通用融合表達載體pET-mLTA-VP2-CTLA-4-MCS-IgV，此融合蛋白能否協(xié)同發(fā)揮各自的生物學特性具有很大的臨床研究價值。
　　為獲得細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4(CTLA-4)胞外區(qū)序列，我們根據(jù)GenBank發(fā)表的CTLA-4基因序列設計引物，利用重疊延伸PCR方法引入了5個酶切位點，構建重組載體pET-CTLA-4-MCS-IgV，然后克隆入去毒大腸埃希菌不耐熱腸毒素(mL

4、TA)基因，構建重組質(zhì)粒載體pET30a-mLTA-CTLA-4，測序鑒定正確后轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，進行IPTG誘導表達后，SDS-PAGE檢測時清晰可見約42.5 kD的目的蛋白，與預期結果一致，表明重組菌pET30a-mLTA-CTLA-4構建成功。
　　為了構建IBDV VP2融合表達重組菌pET-mLTA-VP2-CTLA-4-MCS-IgV，比對GenBank發(fā)表的IBDV VP2基因序列，進行基因優(yōu)化后合成VP2基因

5、，將其克隆入研究一制備的質(zhì)粒載體pET-mLTA-CTLA-4-MCS-IgV，經(jīng)鑒定正確后轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，經(jīng)IPTG誘導表達。SDS-PAGE檢測時清晰可見約92KD的目的條帶，與預期結果相一致，表明重組菌pET-mLTA-VP2-CTLA-4-MCS-IgV構建成功，為進一步開發(fā)IBDV亞單位疫苗奠定了基礎，且經(jīng)Western-blot分析證實表達的重組蛋白mLTA-CTLA-4和mLTA-VP2-CTLA-4抗原性良好。

6、r>　　為了研究融合蛋白mLTA-VP2-CTLA-4的免疫保護效果以及作為IBD新型亞單位疫苗的可行性，將表達的mLTA-CTLA-4、mLTA-VP2-CTLA-4兩種蛋白純化后進行動物實驗，將360只10日齡非免疫健康雛雞隨機平均分為6組，第1、2、3組用不同劑量的mLTA-VP2-CTLA-4融合蛋白肌肉注射免疫;第4組mLTA-CTLA-4融合蛋白肌肉注射免疫;第5組只用疫苗免疫;第6組為生理鹽水對照組。首免后7天加強免疫一次