素心蠟梅體外植株再生及SSR和AFLP反應(yīng)體系建立.pdf

1、蠟梅(Chimonanthus)是中國種群中一種典型的物種，它是中國地方樹種，是第三紀(jì)孑遺植物。蠟梅在中國種植廣泛，灌木，樹高2.5-3.0米。在北半球，蠟梅冬令開花，黃冠晶瑩，清香四溢，花期從次年12月到第二年1月，尤其是在1月中旬開花。蠟梅耐寒，短時(shí)期內(nèi)能耐-18℃的低溫。蠟梅為中國特有的花卉植物，品種多，具有較高的觀賞價(jià)值，發(fā)展蠟梅對(duì)于改善生態(tài)環(huán)境條件，提高人民生活水平和增加農(nóng)民經(jīng)濟(jì)收入具有重要的生態(tài)、經(jīng)濟(jì)和社會(huì)意義。
　　

2、 本文以素心蠟梅(ChimonanthuspraecoxLink.var.concolor)為材料，開展其體外植株再生體系建立及SSR和AFLP技術(shù)體系建立及引物篩選工作。現(xiàn)將研究結(jié)果歸納如下：
　　 (1)建立了素心蠟梅體外植株再生體系。蠟梅愈傷組織最適培養(yǎng)基為MS+2.0mg·L-16-BA+0.9mg·L-1NAA，誘導(dǎo)率達(dá)到93.5％。不定芽誘導(dǎo)最適培養(yǎng)基為WPM+2.37mg·L-1TDZ+1.48mg·L-1NAA

3、，最高誘導(dǎo)率為71.33％，最適合的生根培養(yǎng)基是用1/2MS+1.5mg·L-1IBA培養(yǎng)30天，生根率達(dá)80％。
　　 (2)建立了SSR反應(yīng)體系。通過對(duì)影響蠟梅SSR擴(kuò)增效果的模板DNA，dNTP，引物濃度，Taq酶和退火溫度等因素的篩選，建立了其適宜的蠟梅SSR分子標(biāo)記反應(yīng)體系，同時(shí)篩選了適宜蠟梅SSR擴(kuò)增引物。結(jié)果表明，蠟梅SSR擴(kuò)增的適宜退火溫度為55℃，在20μL反應(yīng)體系中，蠟梅模板DNA、dNTP、引物濃度分別為5

4、mg·L-1、0.2mmol·L-1和0.5μmol·L-1，Taq酶和10xTaq酶緩沖液量則為2U和2.5μL。利用建立的反應(yīng)體系，從不同木本植物SSR擴(kuò)增的417對(duì)引物中篩選出了適合蠟梅SSR擴(kuò)增的41對(duì)引物。
　　 (3)建立了AFLP反應(yīng)體系。通過對(duì)影響AFLP反應(yīng)體系的各主要因素的研究，建立了適于蠟梅AFLP分析的技術(shù)體系。結(jié)果表明，蠟梅AFLP最佳酶切體系(20μL)為模板DNA600ng，PstⅠ和MseⅠ各為3

5、U，在37℃下雙酶切2h；在20μL最佳連接體系中酶切產(chǎn)物為15μL，3UT4連接酶，0.25μmol·L-1PstⅠ接頭，2.5μmol·L-1MseⅠ接頭，1μL10×T4buffer，在22℃下連接10h；在20μL最佳預(yù)擴(kuò)反應(yīng)體系中稀釋10倍的連接產(chǎn)5μL，2.0mmol·LMg2+，2UTaq酶，300μmol·L-1dNTP，0.5μmol·L-1PstⅠ和MseⅠ引物(P+AGA/M+ATC)；在20μL最佳選擇性擴(kuò)增反應(yīng)