家蠶中腸細(xì)胞培養(yǎng)及飼料成分刺激反應(yīng)的研究.pdf

1、人工飼料養(yǎng)蠶是蠶業(yè)生產(chǎn)的一項重大技術(shù)革新。目前,國內(nèi)外主要采用活體家蠶進(jìn)行人工飼料配方及成分的物質(zhì)能量代謝試驗和飼養(yǎng)試驗,但活體生物家蠶對飼料的適應(yīng)性受季節(jié)、溫度、品種品系等因素的影響較大。若采用腸上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)物對人工飼料的配方及營養(yǎng)效用進(jìn)行評價研究,則可以避免上述影響。家蠶中腸是家蠶消化器官最發(fā)達(dá)的部分,它不僅是消化吸收營養(yǎng)的場所,也是進(jìn)行物質(zhì)和能量代謝的重要器官。目前,在家蠶的組織研究中,中腸的研究大多集中在物質(zhì)代謝和細(xì)胞化學(xué)

2、等方面,而中腸上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)及原代培養(yǎng)物對外來刺激的反應(yīng)還鮮有報道。家蠶作為一種模式昆蟲,應(yīng)用家蠶培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行理論研究和生產(chǎn)應(yīng)用倍受關(guān)注。雖然早在20世紀(jì)30年代,William Tmger就開始了家蠶細(xì)胞培養(yǎng)的研究,但是到目前為止,仍沒有家蠶中腸細(xì)胞系的研究報道,這主要是缺少理想的培養(yǎng)基和科學(xué)有效的培養(yǎng)方法,特別是成功的原代培養(yǎng)方法。
　　 本實驗的研究目的在于:制備可用于家蠶細(xì)胞培養(yǎng)的去細(xì)胞血淋巴液及家蠶組織勻漿液。以家

3、蠶中腸組織為材料進(jìn)行原代培養(yǎng),摸索原代培養(yǎng)的條件和方法.考察現(xiàn)行家蠶人工飼料主要成分對中腸細(xì)胞增殖的影響,為家蠶飼料開發(fā)研究提供細(xì)胞水平的依據(jù)。并期望最終為建立家蠶消化道細(xì)胞系,為藥物藥效的體外敏感性試驗.提供前期實驗鋪墊。主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下:
　　 1.家蠶培養(yǎng)基及培養(yǎng)用液的制備
　　 本試驗通過離心、過濾、透析等方法,獲得家蠶去細(xì)胞血淋巴液,并通過添加維生素C防止酪氨酸酶氧化。制備得到的去細(xì)胞血淋巴液,呈淡黃色,

4、透明狀,稍有粘性,經(jīng)測定pH值為6.3±0.3,蛋白濃度為25.4mg/100mL。家蠶經(jīng)去除頭部、消化管、馬氏管、肛門后,得到的組織通過與PBS液混合勻漿,得到白色、透明狀的家蠶組織勻漿液,經(jīng)測定pH值為6.5±0.1,蛋白的濃度為69.6mg/100ml。
　　 2.家蠶中腸細(xì)胞的培養(yǎng)及生長指標(biāo)的檢測
　　 本試驗以2-3齡眠期家蠶幼蟲中腸組織為材料,分別以Grace's培養(yǎng)基和家蠶組織勻漿為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,家蠶去細(xì)胞血

5、淋巴液、胎牛血清、家蠶組織勻漿為輔加成分,配制6種不同營養(yǎng)成分的培養(yǎng)基(①Grace's基礎(chǔ)培養(yǎng)基+20%(VN)家蠶組織勻漿液;②Grace's基礎(chǔ)培養(yǎng)基+20%(V/V)FBS;⑤Cnace's基礎(chǔ)培養(yǎng)基+20%(V/V)家蠶去細(xì)胞血淋巴液;④家蠶勻漿液+20%(V/V)FBS;⑤家蠶組織勻漿液+20%(VN)家蠶去細(xì)胞血淋巴液;⑥家蠶組織勻漿液);取家蠶后部絲腺來源的絲素蛋白,制備成可供細(xì)胞生長的粘附材料;對中腸細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng),

6、并對成功傳代細(xì)胞的生長狀況、細(xì)胞生長曲線、細(xì)胞分裂指數(shù)、細(xì)胞接種存活率等相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行檢測。通過對比不同培養(yǎng)基培養(yǎng)家蠶中腸細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)以Grate's培養(yǎng)基為基礎(chǔ),分別添加20%(V/V)家蠶去細(xì)胞血淋巴液和胎牛血清的實驗組,細(xì)胞能在原代接種培養(yǎng)的第25d,穩(wěn)定生長,并在70-75d,達(dá)到80%鋪瓶率。傳代培養(yǎng)后第45d,細(xì)胞達(dá)到80%鋪瓶率。通過觀察培養(yǎng)物主要由3種類型的細(xì)胞混合組成。分別為:呈扁平的梭型或卵圓型的細(xì)胞,單層生長,邊界清晰

7、;另一類細(xì)胞呈長梭型,中央有卵圓形核,排列整齊。同時還有少量的細(xì)胞呈紡錘形。通過對Grace's基礎(chǔ)培養(yǎng)基+20%(V/V)FBS組和Grace's基礎(chǔ)培養(yǎng)基+20%(VN)家蠶去細(xì)胞血淋巴液組傳代細(xì)胞的生長曲線和接種存活率的測定發(fā)現(xiàn),第一次傳代培養(yǎng)的細(xì)胞生長緩慢,接種后有7-10d的潛伏期,從22-45d和20-39d分別是這兩組細(xì)胞的對數(shù)生長期。在45d和39d時,兩組細(xì)胞濃度達(dá)到頂峰,達(dá)到80%鋪瓶率。在其余3種完全培養(yǎng)基中,未觀

8、察到細(xì)胞。
　　 3.人工飼料成分對中腸細(xì)胞的刺激反應(yīng)
　　 為進(jìn)一步探討家蠶人工飼料中原料的安全指標(biāo),以生長對數(shù)期的中腸細(xì)胞為對象,用不同的飼料成分原液刺激細(xì)胞,測定其對細(xì)胞增殖的影響。不同比例的桑葉汁(40%、20%、10%、5%),蠶蛹蛋白(15%、10%、5%、2.5%、1%),脫脂大豆粉(15%、10%、5%、2.5%、1%),山梨酸(10%、5%、2.5%、1%、0.5%),丙酸鈣(10%、5%、2.5%、1

9、%、0.5%),氯霉素(0.02%、0.01%、0.005%、0.002%、0.001%),土霉素(0.02%、0.01%、0.005%、0.002%、0.001%)的細(xì)胞增殖試驗結(jié)果表明,桑葉各比列原液刺激細(xì)胞后平均細(xì)胞相對增殖率都大于90%,沒有細(xì)胞毒性。脫脂大豆的濃度在2.5%以下,蠶蛹蛋白的濃度在5%以下,能保持細(xì)胞的增值活性。對于山梨酸、丙酸鈣濃度大于2.5%則使細(xì)胞增值活性大幅度降低,細(xì)胞出現(xiàn)死亡。氯霉素和土霉素在0.005